As hemácias, também chamadas de glóbulos vermelhos ou eritrócitos, correspondem à maior quantidade de células circulantes do sangue. Têm, como principal função, o transporte de gases sanguíneos, sendo oxigênio o principal. Além disso, têm um tempo de vida de, aproximadamente, 120 dias no sangue periférico.
O exame “hemograma” apresenta uma avaliação minuciosa dos eritrócitos, tendo, como parte dessa análise, a contagem de eritrócitos por mm³ de sangue. Para a realização da contagem de hemácias, dois métodos podem ser aplicados: a contagem manual e a contagem automatizada. A contagem manual é feita a partir da utilização da câmara de Neubauer, na qual o sangue é diluído em proporção conhecida em líquido de Hayem, que mantém a integridade da célula no meio. Contudo, essa metodologia não é muito indicada devido à alta chance de erros.
Os aparelhos hematológicos, geralmente, utilizam o método de contagem de pulso de impedância (princípio de Coulter) para realizar a contagem dos eritrócitos. Assim, a contagem automatizada apresenta maior precisão e resultados mais confiáveis.
A elevação da quantidade de eritrócitos pode estar associada a policitemias, e a redução aos processos anêmicos. Os valores de eritrócitos se diferem quando relacionados à idade e ao sexo. Sendo assim, há valores de referência diferentes de acordo com as variáveis:
Valor de referência para homem adulto: 4,5 - 5,9 Milhões/mm³.
Valor de referência para mulher adulta: 4,0 - 5,2 Milhões/mm³.
Valor de referência para recém-nascidos: 3,9 - 6,0 Milhões/mm³.
As plaquetas, também chamadas de trombócitos, são fragmentos citoplasmáticos de megacariócitos (por isso, não são consideradas células), que participam ativamente dos eventos relacionados à hemostasia.
O exame hemograma também fornece uma avaliação quantitativa das plaquetas: a contagem de plaquetas. Em alguns laudos, além da quantidade de plaquetas, outros resultados também são fornecidos, a fim de obter uma análise plaquetária mais minuciosa. Isso inclui: plaquetócrito (PCT), índice de anisocitose plaquetária (PDW), volume plaquetário médio (VPM), índice de plaquetas imaturas (IPF) e marcador de macroplaquetas e plaquetas gigantes (P-LCR), formando, assim, o plaquetograma.
A avaliação morfológica das plaquetas em lâmina apresenta grande importância quando se trata da investigação dos problemas relacionados à hemostasia. A contagem total de plaquetas pode ser realizada a partir de métodos automatizados, os quais fornecem um resultado mais satisfatório devido à precisão dos contadores hematológicos, ou mediante a contagem manual em câmara de Neubauer. A realização da metodologia manual exige um grande rigor técnico e faz uso de líquidos hemolisantes ou não hemolisantes.
Além da metodologia realizada tradicionalmente em câmara de Neubauer, a contagem total de plaquetas pode ser realizada em esfregaço sanguíneo corado, a partir de alguns métodos, como Fônio modificado, Bárbara O’connor, dentre outros. O número de plaquetas em um indivíduo pode variar entre 150.000 e 450.000/mm³. A redução do valor de plaquetas é denominada “plaquetopenia” ou “trombocitopenia”, enquanto o aumento do valor de plaquetas é definido como “plaquetose” ou “trombocitose”. É preciso lembrar que esse resultado não avalia a função das plaquetas, apenas as quantifica.
Nota: na grande maioria, os valores de plaquetopenia podem estar associados a erros pré-analíticos. Dessa forma, uma nova coleta da amostra deve ser realizada, a fim de confirmar o resultado.
O objetivo desta aula é determinar o valor total de hemácias e plaquetas por mm3 de sangue a partir da metodologia de contagem manual em câmara de Neubauer e interpretar os resultados obtidos.
Luva descartável
Tubos de ensaio para 8 ou 10 mL
Estante para tubos
Canetas para identificação
Micropipeta para 20 µL
Ponteiras
Descarte de ponteira
Câmara de Neubauer
Água destilada
Placa de Petri grande
Tubo com sangue total em EDTA
Papel higiênico
Líquido de Hayem
Microscópio
Lamínula paracâmara de Neubauer
Algodão
Homogeneizador automático para tubos
Luva descartável
Tubos de ensaio
Estante para tubos
Canetas para identificação
Micropipetas para 20 µL
Micropipetas para 400 µL
Ponteiras
Descarte de ponteira
Câmara de Neubauer
Água destilada
Placa de Petri grande
Tubo com sangue total em EDTA
Papel higiênico
Solução de oxalato de amônio a 1%
Microscópio
Lamínula paracâmara de Neubauer
Algodão
Homogeneizador automático para tubos
Aliquotar o líquido de Hayem em um béquer;
Pipetar 4mL de líquido de Hayem em um tubo de ensaio;
Pipetar 20μL de sangue total homogeneizado (limpar a ponteira externamente com papel absorvente) no líquido diluidor (lavando a ponteira no líquido diluidor a fim de retirar toda amostra da mesma);
Tampar o tubo e homogeneizar por inversão;
Preencher corretamente a câmara de Neubauer;
Deixar a câmara de Neubauer em repouso por 5 minutos em câmara úmida;
Ajustar a câmara de Neubauer na mesa do microscópio;
Regular a luz do microscópio: intensidade no máximo, diafragma quase fechado e condensador baixo;
Focalizar o material em objetiva de 10x ou 40x (começando pela objetiva de menor aumento até de maior aumento);
Realizar a contagem em 5 quadrantes centrais da câmara de Neubauer;
Somar o valor contado em todos os quadrantes e multiplicar o valor da soma de hemácias por 10.000 ou utilizar a seguinte fórmula:
He/mm³ = He contadas x 5 x 10 x 200
Em que:
5 = fator de conversão para 1 mm²;
10 = fator de conversão para 1 mm³;
200 = fator de conversão da diluição.
Interpretar o resultado.
Pipetar 400 μL de solução diluidora hemolisante no tubo de ensaio;
Transferir 20 μL de sangue bem homogeneizado, limpar a ponteira externamente com papel absorvente e lavá-la no líquido diluidor;
Homogeneizar e aguardar 5 minutos (para ocorrer a hemólise);
Homogeneizar novamente;
Preencher corretamente a câmara de Neubauer;
Colocar a câmara de Neubauer em uma placa de Petri contendo algodão úmido (câmara úmida) por 15 minutos (para sedimentação das plaquetas);
Ajustar a câmara de Neubauer na mesa do microscópio;
Regular a luz do microscópio: intensidade no máximo, diafragma quase fechado e condensador baixo;
Focalizar o material em objetiva de 40x (começando pela objetiva de menor aumento até de maior aumento);
Realizar a contagem em 5 quadrantes centrais da câmara de Neubauer;
Somar o valor contado em todos os quadrantes e multiplicar o valor da soma de plaquetas por 1.000 ou utilizar a seguinte fórmula:
Plaquetas / mm³ = plaquetas contadas x 5 x 10 x 20
Em que:
5 = fator para área da câmara;
10 = fator para o volume da câmara;
20 = fator da diluição.
Imagem 1 - Características dos eritrócitos
Fonte: a autora.
Morfologia do eritrócito em sangue periférico apresentando características normais: redondo, discoide, bicôncavo, anuclear, tamanho uniforme e com coloração vermelha mais intensa nas bordas e mais pálido no centro. (1A) Eritrócitos visualizados em microscópio óptico após a coloração com corantes hematológicos e (1B) eritrócitos em formato 3D.
Imagem 2 - Hemácias visualizadas no microscópio em aumento de 40x durante a contagem manual
Fonte: a autora.
Trata-se de hemácias visualizadas em câmara de Neubauer diluídas em líquidos de Hayem durante a contagem manual.
Imagem 3 - Contagem de hemácias e plaquetas em câmara de Neubauer
Fonte: Vivas ([2022], p. 8).
A contagem de hemácias/plaquetas é realizada de forma semelhante na câmara de Neubauer. Para ambas, deve ser contada a quantidade de hemácias/plaquetas em cinco quadrantes centrais, indicados na imagem pela letra H (3A). Para cada quadrante contato, deve seguir a regra da imagem (3B): contar as hemácias/plaquetas sobrepostas nas linhas de apenas dois lados do quadrante, assim como mostram as células indicadas na cor preta da imagem. Nesse caso, apenas as hemácias/plaquetas representadas pela cor preta deverão ser contadas. Após a contagem, a fórmula utilizada para a realização do cálculo é diferente para cada uma.
Imagem 4 - Megacariócito
Fonte: a autora.
O megacariócito é uma célula grande encontrada na medula óssea. A partir da fragmentação do citoplasma, ocorre a formação das plaquetas, que atingem a corrente sanguínea a partir dos sinusoides.
Imagem 5 - Plaquetas visualizadas na microscopia
Fonte: a autora.
As setas indicam as plaquetas visualizadas em microscopia óptica com aumento de 40x, diluídas em líquido não hemolisante.
1) Um profissional de um laboratório, com o intuito de liberar o valor total de eritrócitos, preparou a diluição dos eritrócitos em líquido de Hayem e, depois, preencheu a câmara de Neubauer. As imagens a seguir são referentes às hemácias visualizadas na microscopia (aumento de 40x), mais especificamente, durante a contagem. Determine a quantidade de eritrócitos do paciente e interprete o resultado.
2) Durante a contagem de plaquetas na câmara de Neubauer, utilizando oxalato de amônio como líquido diluidor, o analista contou: 59 plaquetas no quadrante superior direito, 68 no quadrante superior esquerdo, 61 no quadrante central, 72 no quadrante inferior direito e 64 no quadrante inferior esquerdo. Calcule o valor de plaquetas do paciente.
2) O valor de plaquetas do paciente é 324.000/mm3. O resultado está dentro do valor da referência. Contudo, não exclui as alterações funcionais das plaquetas.
FAILACE, R. Hemograma: manual de interpretação. Porto Alegre: Artmed, 2015.
SILVA, P. H. da et al. Hematologia laboratorial: teoria e procedimentos. Porto Alegre: Artmed, 2016.
VIVAS, W. L. P. Manual prático de hematologia. [S. l.: s. n.], [2022]. Disponível em: http://docente.ifsc.edu.br/rosane.aquino/MaterialDidatico/AnalisesClinicas/hemato/Manual%20de%20Hematologia.pdf. Acesso em: 25 out. 2022.