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TP n°3 : Antibiogramme

    Cette expérience a pour but de mettre en évidence les effets des antibiotiques sur les bactéries. Elle permettra de répondre aux hypothèses suivantes :
        -Les antibiotiques agissent de manière inégale sur un même type de bactérie
        -Touts les antibiotiques ne fonctionnent pas sur toutes les bactéries
        -La solution extraite dans la manipulation n°2 contient des substances antibiotiques.

    pour des raisons évidentes de sécurité, la seul souche bactérienne manipulable pour nous est celle de la bactérie E. Coli.

Protocole :

Le principe de l'antibiogramme est de mettre en culture des bactéries, et d'appliquer un disque contenant un antibiotique, afin de voir quels effets il joue sur la bactérie ciblée.
8 boites de gélose sont nécessaire à cette manipulation :

  • 1 boite témoin (sans aucun antibiotique, seulement la suspension bactérienne).

Des boites contenants 4 antibiotique différents

  • 1 boite contenant de la pénicilline G.
  • 1 boite contenant de l'ampicilline.
  • 1 boite contenant de la Tétracycline.
  • 1 boite contenant de l'Acide Nalidixique.

Des boites contenant des substances dont on veut vérifier l'effet antibiotique ou non.

  • 1 boite contenant du linalol.
  • 1 boite contenant de l'acétate de linalyle.
  • 1 boite contenant de l'huile essentielle de lavande.

Matériels nécessaire :

- 8 boites de pétri

- Une suspension bactérienne

- Du désinfectant

- Un bec Bunsen

- Des pinces stériles

- pipettes graduées, pro-pipettes

- Râteaux

-  Antibiotiques à tester.


  • Nettoyer la paillasse avec le désinfectant afin de minimiser les risques de contamination extérieur lors de la manipulation.
  • Allumer le bec Bunsen afin de stériliser l'air alentour et détruire ainsi les organismes pouvant altérer les résultats. Toute la manipulation doit se faire dans un rayon de 20/25 cm autour de la flamme.
  • Verser dans chaque boite de pétri 100µl de suspension bactérienne d'E. Coli, soit environ 3 gouttes, puis étaler la suspension sur toute la surface de la gélose afin d'obtenir une quantité la plus homogène possible de bactéries à la surface.
  • Laisser sécher la suspension pendant environ 20'.
  • A l'aide d'une pince stérile, prélever un disque antibiotique et le déposer au centre d'une boite de pétri, puis l'appuyer légèrement pour l'enfoncer dans la gélose. Renouveler l'opération pour les 4 antibiotiques, en prenant soin de changer de pinces à chaque nouvel antibiotique.
  • Pour les solutions à tester, prélever un morceau de papier filtre stérilisé, puis déposer dessus 1 ou 2 gouttes de la solution grâce à une pipette, de sorte que le papier filtre absorbe entièrement la solution.
  • Déposer ensuite le papier filtre imbibé au centre de la gélose, tout comme pour les disques antibiotiques.
  • Renouveler les opérations pour les 3 solutions, en prenant à chaque fois du nouveau matériel stérile.
  • Placer les Antibiogrammes dans une étuve pendant 24h, le temps que la bactérie E. Coli se développe.
  • Observer les résultats.

La vidéo montrant le déroulement de l'expérience :

TP n°3 : Antibiogramme



Résultats

    Les bactéries, durant l'étuvage, vont se développer; Le disque antibiotique va quant à lui diffuser l'antibiotique, et plus on s'écarter du disque, moins l'antibiotique est puissant, du fait de la dilution de l'antibiotique. Il y aura donc une zone où les bactéries et les antibiotiques seront en contact. Si les bactéries sont sensibles à l'antibiotique, elle vont être détruite ou inactivé, et ne pas se développer dans la zone où il se trouve. Cela va créer une zone plus ou moins importante sans développement bactérien autour de l'antibiotique, qui va permettre de montrer l'efficacité de ce dernier sur la bactérie en comparant son champ d'action avec celui d'un autre antibiotique.

Voici les différents résultats obtenus selon l'antibiotique utilisé :
Ampicilline  Acide nalidixiqueTétracycline
 Pénicilline G
Huile essentielle de lavande
Acétate de linalyle

Linalol

Différents constats sont possibles :


    - Hypothèse 1 : A l'exemple de la tétracycline et de l'ampicilline, des antibiotique agissent sur la bactérie E. Coli, tandis que d'autre antibiotique, comme la pénicilline G, n'ont aucune action sur la bactérie. Ce constat met en évidence que les antibiotiques n'agissent pas sur toute les bactéries. (voir l'utilisation des antibiotiques)

Sur les photos ci-dessous, on remarque facilement la zone d'inhibition (en rouge) causée par l'antibiotique. Sur la pénicilline, elle est inexistante.



    - Hypothèse 2 : Le constat précédent indiquait que la pénicilline G était inefficace sur la bactérie E. Coli; Une autre hypothèse peut être formulée : la pénicilline agit normalement sur la bactérie, mais celle-ci a acquit des résistances par divers procédés, lui permettant de ne pas être affectée par cette antibiotique. (voir les limites des antibiotiques - les résistances)



    -Même si plusieurs antibiotiques agissent sur la bactérie, on remarque que la zone d'inhibition est plus ou moins importante d'un antibiotique à l'autre. Par exemple, l'acide nalidixique a une zone d'inhibition près de 10 fois inférieur à celui de l'ampicilline! On peut donc dire que même si des antibiotiques agissent sur une bactérie, certains seront plus efficace que d'autre. (voir l'utilisation des antibiotiques)

En rouge, la zone d'inhibition de l'ampicilline, et en bleu celle de l'acide nalidixique



    -Sur l'antibiogramme de l'huile essentielle de lavande, extraite durant la manipulation n°2, on remarque une légère zone d’inhibition (les bactéries sont présentes, mais moins concentrées). De plus, la zone d'inhibition du linalol est très marqué, c'est donc une substance antibiotique. On peut donc affirmer que les antibiotiques sont présents mais aussi issus des produits naturels. (voir L'utilisation des antibiotiques - définition, et Les alternatives aux antibiotiques - les produits naturels)


   (A gauche) En bleu, la zone d'inhibition de l'huile essentielle; Suite à une trop grande quantité d'huile déposée, celle-ci a coulé sur la gélose, produisant une zone étendue. En rouge, une zone où les bactéries sont encore moins nombreuses. (A droite) On peut noter une zone d'inhibition marquée pour le linalol.



    -La manipulation n°2 a démontré que le linalol était présent dans l'huile essentielle. Pourtant, le linalol concentré utilisé pour l'antibiogramme a un meilleur pouvoir antibiotique que l'huile essentielle. Ce phénomène peut s'expliquer par le fait que le linalol est beaucoup moins concentré dans l'huile. On aurait alors un nouveau facteur jouant dans la force d'action d'un antibiotique, à savoir une intensité plus forte entrainant un plus fort pouvoir antibiotique. (voir l'utilisation des antibiotiques - mode d'action)

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