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Tuber anniae, algunas recolectas en España.
Tuber anniae, algunas recolectas en España.
F. Sáinz & P. Mª Pasaban.
Disponible en línea el 10 de junio de 2022.
Introducción
Tuber anniae W. Colgan & Trappe (1997: 438), fué descrita por primera vez en EE. UU. En 2013 se informa de su aparición en Europa, concretamente en Finlandia (WANG et al. 2013).
En la base de datos de Genbank encontramos secuencias de Polonia, Estonia, Letonia y Canadá, en gbif.org https://www.gbif.org/es/occurrence/search?taxon_key=5499317 se recogen recolectas de Dinamarca y Noruega, además de otros países ya citados.
En América, además de en EE. UU. se conocen recolectas en México ( Piña Páez C. et al. 2018).
Aquí queremos dar a conocer algunas recolectas realizadas en España, que en su día determinamos con grandes dudas como Tuber puberulum, y que hoy con ayuda del análisis del ADN podemos rectificar su determinación.
Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Navarra, Ezkurra, bajo Pinus radiata.
Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Gipuzkoa, Tolosa, bajo Pseudotsuga menziesii
Materiales y métodos
Los ascocarpos estudiados se recolectaron en las siguientes fechas y lugares:
Especímenes secuenciados.
16.11.2016, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, Final camino Refugio Cazadores, bajo Pinus radiata, leg. F. Sáinz & P.M. Pasaban. Herb. PSS.155.009. Secuencia ITS Genbank ON623078.
23.12.2019, España, Comunidad Autónoma Pais Vasco, Gipuzkoa, Tolosa, Gurutzondo, bajo Pseudotsuga menziesii leg. P.M. Pasaban. Herb. PSS.155.010. Secuencia ITS Genbank ON623079.
Colecciones adicionales examinadas
30.06.2007, España, Comunidad Autónoma Castilla y León, Burgos, Villafranca Montes de Oca, 42°21'45"N 3°22'01"W, Valdefuentes bajo Pseudotsuga menziesii, leg. F. Sáinz. Herb. PSS.155.001.
29.05.2011, España, Comunidad Autónoma Castilla y León, Burgos, ibíd. Herb. PSS.155.002.
19.06.2011, España, Comunidad Autónoma Castilla y León, Burgos, ibíd. Herb. PSS.155.003.
10.01.2008, España, España, Comunidad Autónoma Pais Vasco, Gipuzkoa, Albiztur, ladera Intxurre, bajo Pseudotsuga menziesii leg. P.M. Pasaban. Herb. PSS.155.004.
16.07.2014, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, Final camino Refugio Cazadores, bajo Pinus radiata, leg. F. Sáinz & P.M. Pasaban. Herb. PSS.155.005.
12.11.2014, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, ibíd. Herb. PSS.155.006.
15.07.2015, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, ibíd. Herb. PSS.155.007.
17.09.2015, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, ibíd. Herb. PSS.155.008.
07.11.2017, España, Comunidad Autónoma de Navarra, Ezkurra, ibíd. Herb. PSS.155.011.
Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Gipuzkoa, Albiztur , bajo Pseudotsuga menziesii
Método
Los caracteres macroscópicos y microscópicos se describen a partir de ejemplares frescos.
Para el estudio microscópico se utilizaron dos microscopios binoculares Uratecnic con objetivos planos acromáticos de 4x, 10x, 40x y 100x en inmersión de aceite y oculares 10x. Las fotografías tanto de imágenes de campo como de microscopía fueron realizadas con cámaras digitales Canon de los modelos PowerShot G6, PowerShot A650 IS y PowerShot A590 IS.
Se determinaron los caracteres microscópicos con preparaciones montadas en agua y en rojo congo. Para la medición de esporas se partió de imágenes digitales obtenidas a través de un ocular 10x dotado de regla micrométrica y se utilizó el programa informático Mycometre de Georges Fannechère. Las medidas de las ascas se basan en una medición de 50 ascas, las de las esporas en mediciones de 20, 50, 50 y 40 esporas seleccionadas aleatoriamente, para ascas de 1, 2, 3 y 4 esporas respectivamente.
Muestras de estas recolectas fueros enviadas a un laboratorio privado para la extracción, amplificación, secuenciación y codificación de barras de los Espaciadores Transcritos Internos (ITS) ampliada con los cebadores ITS1f e ITS4, también se secuenció el gen TLF1.
Las secuencias ITS, fueron editadas y recortadas manualmente con el programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.2.5 (Hall, 1999). Se compararon en la base de datos pública GenBank del NCBI mediante el uso del algoritmo BLASTn para buscar secuencias similares ( Altschul et al. 1990).
De dicha base se seleccionaron las siguientes secuencias:
JF792504 Tuber sp. Canadá, JQ712002 Tuber pacificum Canadá, KP972060 Tuber anniae Canadá, MF954683 Tuber anniae Canadá, AJ534705 Tuber sp. Estonia, HM775402 Tuber anniae Finlandia, HM775403 Tuber anniae Finlandia, HM775404 Tuber anniae Finlandia, HM775405 Tuber anniae Finlandia, MZ389970 Tuber anniae Finlandia, MZ389971 Tuber anniae Finlandia, JN207851 Tuber anniae Finlandia, KR019796 Tuber anniae Letonia, KT182909 Tuber anniae Letonia, MH174660 Tuber anniae México, MN459765 Tuber anniae Polonia, MN459766 Tuber anniae Polonia, MZ567817 Tuber anniae Polonia, HM485338 Tuber anniae Usa, HM485339 Tuber anniae Usa, JX094351 Tuber anniae Usa, KU186937 Tuber anniae Usa, KU186938 Tuber anniae Usa, EU697267 Tuber pacificum, EU837241 Tuber pacificum, KP972058 Tuber anniae, MK955493 Tuber anniae.
Estas secuencias alineadas con BioEdit/Clustaw multiple alignment, se procesaron en el servidor web de IQ-TREE (Trifinopoulos J et al. 2016) aplicando las opciones “Find best and apply”, “Ultrafast” y número de réplicas del bootstrap = 1000. El archivo iqt.tree obtenido se editó con MEGAX10 (Kumar et al. 2018), obteniendo el siguiente árbol filogenético.
Árbol filogenético de máxima verosimilitud (ML) inferido de secuencias ITS.
Las secuencias obtenidas en el presente estudio se destacan remarcadas en rojo.
Las secuencias EU697247 y EU837241 Tuber pacificum se utilizaron como grupo externo.
La barra de escala indica los cambios esperados por sitio.
Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Resultados filogenéticos
Las secuencias ITS de nuestros ejemplares, encuadrados dentro del clado II, tienen una similitud del 98,77% en el caso de Ezkurra y del 98,59% en el caso de Tolosa con respecto al holotipo HM485338 Tuber anniae utilizado en Finlandia (WANG et al. 2013).
En el caso de México, su secuencia MH174660 T. anniae ( Piña Páez C. et al. 2018) obtiene una similitud del 100% con nuestra recolecta de Ezkurra y un 99,82% con nuestra recolecta de Tolosa.
Estos resultados son respaldados por los obtenidos con la comparación mediante BLASTn de nuestras secuencias TLF1 con la secuencia de Genbank JX022568 T. anniae que obtienen una similitud del 100% en el caso de Ezkurra y del 99,55% en el caso de Tolosa.
Descripción
Ascocarpos, nuestros ejemplares están asociados a Pinus radiata y Pseudotsuga menziesii, creciendo hipogeos a profundidad de 2 a 4 cm., entre el enraizado de la hierba que cubre el suelo del bosque, ejemplares de hasta 2,5 cm. de diámetro, tuberosos, de forma esférica o subesférica frecuentemente con lóbulos irregulares, que según el relieve en algunos ejemplares, reunidos éstos forman uno o varios ombligos. Cuando son muy jóvenes son totalmente blancos de color lácteo, pasando después de color marfil hasta débilmente pardo, en la vejez plúmbeo de superficie satinada cerosa.
Gleba, plena, marmórea, de aspecto céreo, en ejemplares jóvenes de color blanco, lácteo en las venas y blanco marfil el resto, en la madurez pasa a gris purpureo, con las venas blancas. Olor nulo o débilmente herboso.
Ascocarpos y detalle de gleba de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Microscopía del peridio de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Peridio, delgado y concolor al exterior, adherido en un todo con la gleba. Se diferencian dos capas, una exterior parenquimática, con células globoso-redondeadas hasta poligonales, de hasta 25 µm., pasando a una capa interior de células cortas entremezcladas tipo plectenquimático. En ejemplares adultos, en la superficie exterior raramente se aprecia algún dermatocistidio cilíndrico romo y corto.
Ascas provistas de un corto pie, globosas, hialinas, con medidas de (64)75–95(100) x (55)64–87(92) µm conteniendo en general de una a tres ascosporas y alguna de cuatro.
Microscopía del peridio de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Asco con una espora de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Asco con dos esporas de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Ascosporas globosas a cortamente elípticas, de (39)40–52(53) x (33)38–47(51) µm. en ascas de una espora, (28)29–39(43) x (25)26–36(37)µm. en ascas de dos esporas, (20)23–32(34) x (18)22–29(31) µm. en ascas de tres esporas y (20)22–28(29) x 20–26(29) µm. en ascas de cuatro esporas, (medidas sin ornamentación). Malla alveolar, de paredes finas, con (4)6–7(9) alveolos al eje largo, de forma y tamaño irregular, poligonales con 5–7 lados curvos, midiendo de media (11)9(7) x (10)8(6,5) µm., con una altura de 5–6 µm.
Ascos y esporas de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Esporas de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Esporas de Tuber anniae W. Colgan & Trappe
Conclusión
Consideramos que nuestras colecciones se corresponden con Tuber anniae W. Colgan & Trappe ya que no encontramos diferencias significativas, ni filogenéticas ni morfológicas, con las colecciones europeas o americanas aquí comparadas.
Agradecimientos
Agradecemos a Antonio Rodriguez Fernandez ( https://www.trufamania.com/ ) por su ayuda y valiosos consejos.
Bibliografía
Altschul, S. F., et al. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology 215, 403–410 (1990) doi:10.1016/S0022‑2836(05)80360‑2
Colgan III W., Trappe J.M. 1997. NATS truffle and truffle-like fungi. 7. Tuber anniae sp. nov. (Ascomycota). Mycotaxon, 64: 437-442.
Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41, 95-98
Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. 2018. MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 35(6):1547–1549.
Piña Páez C., Bonito G.M., Guevara-Guerrero G., Castellano M.A., Garibay-Orijel R., Trappe J.M., Peña Rámirez R. 2018. Description and distribution of Tuber incognitum sp. nov. and Tuber anniae in the Transmexican Volcanic Belt. MycoKeys, 41: 17-27
Trifinopoulos J, Nguyen LT, von Haeseler A, Minh BQ. W-IQ-TREE: a fast online phylogenetic tool for maximum likelihood analysis. (2016) Nucl. Acids Res. 44 (W1): W232-W235.
Wang Xiang-Hua , Gian Maria Niccolò Benucci, Xue-Dan Xie, Gregory Bonito, Matti Leisola, Pei-Gui Liu, Salem Shamekh, Morphological, mycorrhizal and molecular characterization of Finnish truffles belonging to the Tuber anniae species-complex, Fungal Ecology, Volume 6, Issue 4, 2013, Pages 269-280,
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