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DNA Recombinante:

A tecnologia do DNA Recombinante é uma técnica que permite produzir moléculas de DNA a partir da combinação de genes com proveniências diferentes.
Existem três formas fundamentais de obtenção destes genes:
1. Criar-se uma biblioteca de genes ou banco genómico, que consiste numa colecção de um grande número de fragmentos de DNA do genoma que são armazenados em vectores para posteriores utilizações. (vectores -(é um espécie de “transportador” que transfere  o material genético de um genona para outro.).

 

 



Fig.1. Bibliotecas de vectores ou bancos de genómico

 

 

 

2. Fabricar-se o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro (mRNA);


3. Sintetizar-se o gene  na sequência desejada. Isto é feito normalmente para genes que codificam polipéptidos ou proteínas de pequeno tamanho. Para executar esta técnica basta conhecer a sequência de aminoácidos da proteína desejada e, com base no conhecimento do código genético, construir a sequência de nucleótidos que corresponde exactamente à sequência de aminoácidos da proteína.

Depois de se obter o gene de interesse, é necessário que enzimas de restrição cortem o DNA em fragmentos manipuláveis que contêm o gene específico pretendido. Estas enzimas, também conhecidas como endonucleases, são enzimas que clivam a molécula de DNA por hidrólise através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas.

 Este processo ocorre normalmente em bactérias (o DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição), protegendo-as dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o.

Após a clivagem, formam-se fragmentos de DNA, em dupla hélice, mas com uma pequena extensão em cadeia simples em cada extremidade (extremidades coesivas). Estes pedaços de DNA designam-se fragmentos de restrição.

 

 
 


Fig.2. Fragmentos de restrição e extremidade coesivas

 

 

Os fragmentos de DNA que contêm os genes de interesse são, depois, incorporados numa entidade constituída por DNA capaz de transportar o fragmento de DNA para uma célula. Estas entidades designam-se vectores (é um espécie de “transportador” que transfere  o material genético de um genona para outro.). Os bacteriófagos, vírus que atacam as bactérias, podem ser usados como vectores. Muitas bactérias, para além da cadeia de DNA principal, possuem cadeias de DNA livres e de forma circular, os plasmídeos, cujos genes, geralmente, não são essenciais à sobrevivência da bactéria, podendo ser retirados e usados também como vectores.

 

Os plasmídeos podem replicar-se independentemente da molécula de DNA principal e podem também fundir-se com ela. Para além destes vectores mais conhecidos, são usados ainda os lipossomas. Estes são, no essencial, esferas formadas por camadas bilipídicas preenchidas com DNA. Fundem-se espontaneamente com a membrana celular, libertando o seu conteúdo no citoplasma.

 

 

Desta forma, a mesma enzima de restrição que actua no DNA com o gene de interesse, agora actua sobre o vector, cortando a cadeia de DNA deste em zonas específicas, expondo uma sequência nucleotídica complementar.
As extremidades coesivas do fragmento ligam-se, então, à cadeia exposta de DNA do vector, estabelecendo-se ligações de hidrogénio entre bases complementares. A enzima DNA ligase promove a formação de ligações fosfodiéster (ligação com o fosfato – ligação entre nucleótidos complementares entre duas cadeias) entre as extremidades coesivas de cada uma das moléculas de DNA.
Desta forma, é produzida uma molécula híbrida estável, o DNA recombinante.


 

 

Fig.4- Actuação da enzima DNA ligase.

 

 

Uma vez preparados os vectores é necessário inseri-los em células bacterianas. Assim, os vectores são postos em contacto com estas células. Mas, só, algumas bactérias conseguem absorver o DNA novo, sendo necessário seleccionar as bactérias que realmente incorporaram o DNA recombinante.

 

Para facilitar a identificação das bactérias que incorporaram o DNA recombinante, os engenheiros da engenharia genética utilizam os plasmídeos que possuem genes que apresentem resistência a determinado antibiótico. Estes plasmídeos são colocados em contacto com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam. Para seleccionar as bactérias que incorporaram o plasmídeo basta adicionar o antibiótico ao meio de cultivo. Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, restando somente as que possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico. Estas bactérias reproduzem-se e todos os clones resultantes possuirão o plasmídeo com o gene novo.

 

 


 

Fig.5- Utilização do plasmídeo na técnica do DNA Recombinante

 

 

 

Assim, esta técnica permite, por exemplo, introduzir porções de DNA provenientes de vários organismos num microrganismo, e permite a produção de inúmeras cópias do gene (que poderão ser armazenadas nas bibliotecas de genes) ou da proteína codificada por este.

 

Esta técnica tem sido muito utilizada em várias aplicações, alguns exemplos:

 


- Investigação fundamental – esta técnica permite isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.

- Obtenção de organismos geneticamente modificados (OGM). Os OGM ou transgénicos são organismos cujo genoma foi manipulado, apresentando diferenças relativamente à sua constituição original. Esta manipulação permite:

- Produção de alimentos em maior quantidade e qualidade:

 

    • Resistência biológica a pragas e doenças específicas, reduzindo-se a necessidade de pesticidas químicos e diminuindo-se o risco de perdas nas plantações e aumentando a produção;
    • Adaptabilidade a condições adversas de crescimento, tais como seca, solo com alto teor de sal e temperaturas extremas. Por exemplo, modificando a produção de ácido linoleico de uma planta, esta pode resistir melhor a temperaturas baixas;
    • Características funcionais desejáveis, como o retardo no amadurecimento, aumento do conteúdo de amido, ou uma durabilidade maior. Por exemplo, com o rDNA, batatas modificadas podem ter um conteúdo maior de amido, absorvendo menos óleo quando fritamos, resultando em batatas fritas com menos gordura. Também tomates modificados de forma ao seu amadurecimento ser retardado podem permanecer no tomateiro por mais tempo, resultando num sabor e numa cor melhores antes de serem colhidos e enviados para o mercado;
    • Características nutricionais desejáveis, como a alteração do conteúdo de proteínas ou gorduras. Alimentos enriquecidos nutricionalmente podem até mesmo ajudar a prevenir doenças crónicas, por conterem níveis óptimos de nutrientes.

- Produção de grandes quantidades de substâncias com aplicação farmacêutica ou médica.

 

- Produção de substâncias com aplicação industrial – A manipulação genética de organismos pode ser posta em prática para produção de certas proteínas de interesse para a indústria têxtil. Um exemplo disto é proteína da seda produzida por bactérias geneticamente modificadas tendo como objectivo o melhoramento das propriedades da fibra. Também na produção de corantes são usados microrganismos.

 

- Tratamento de doenças – Por exemplo, o rDNA permitiu reverter os efeitos de uma doença genética chamada imunodeficiência combinada grave ligada ao cromossoma X (SCID). Os indivíduos que sofrem desta doença são obrigados a viver em ambientes completamente isolados já que o seu sistema imunitário não defende o corpo de infecções. Num destes casos, a doença impede a produção de glóbulos brancos pela medula óssea. Assim, os cientístas retiram do vírus (vector) os genes que o tornam capaz de causar doenças. No lugar destes, insere-se o gene que produz, de forma correcta, a proteína que se encontra defeituosa no paciente. O vírus modificado é misturado com células da medula óssea retiradas dos pacientes, infectando-as. Com o gene terapêutico, as células passam a produzir a proteína responsável pela estimulação das células de defesa, fazendo com que estas se desenvolvam e se espalhem pelo corpo, destruindo os invasores.


 

 

 

 

 

 

Fig.6- Aplicações da tecnologia do DNA Recombinante

 

 
 

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