Laboratorio de Genética Molecular de Trypanosomátidos


Integrantes
Director:
Dr. Daniel O. Sánchez
    Investigador Principal - CONICET
    Profesor Titular - Universidad Nacional de San Martín.
Investigadores:
Dra. Gabriela Levy
    Investigadora Asistente - CONICET
    Jefe de 
 Trabajos Prácticos - Universidad Nacional de La Matanza
Becarios actuales
Lic. Analia Nittolo, Becaria CONICET
Lic. Carolina Bañuelos, Becaria CONICET
Lic.  Juan Ignacio Saborit, Becario UNSAM
Tesista de Maestría
        Bioq. Jhenny Marion Rojas         
Líneas de investigación
  • Regulación de la expresión génica en trypanosomátidos

    Los Trypanosomas y las Leishmanias constituyen dos de los principales grupos de parásitos del orden kinetoplastida que afectan a una gran parte de la población mundial que vive en áreas poco desarrolladas o en vías de desarrollo. Por ejemplo, Trypanosoma cruzi, causante de la Enfermedad de Chagas, afecta a más de 10 millones de personas en América Latina y se encuentran en riesgo de contraer la enfermedad más de 100 millones. Por otro lado, su contraparte africana,  Trypanosoma brucei afecta a más de 60 millones de personas y a gran parte de los animales domésticos y salvajes al sur del Sahara, de tal forma que estas regiones resultan casi inhabitables. Las distintas especies de Leishmanias, por su parte, afectan a varios millones de personas en América, África, Europa y Asia causando un amplio espectro de enfermedades que van desde leves hasta mortales.

La regulación de la expresión génica en los Trypanosomas es bastante atípica. Los genes que codifican proteínas están organizados en largos policistrones, los que son procesados por un mecanismo concertado de trans-splicing y poliadenilación para generar los transcriptos maduros. Probablemente debido a la organización de sus genes en policistrones, que albergan genes no relacionados entre sí y que pueden diferir ampliamente en la abundancia de sus mRNAs en estado estacionario, se piensa que el principal mecanismo de regulación de la expresión génica en estos organismos es a nivel post-transcripcional. Siendo la regulación de la vida media de los mRNAs, mediante la degradación o estabilización de mRNAs específicos, y el control de la traducción  los más utilizados.

Otro importante punto de control de la expresión génica en trypanosomátidos, si bien menos estudiado, es la regulación del mecanismo de trans-splicing y poliadenilación mediante el cual se procesa los policistrones a mRNAs. Mediante el trans-splicing se realiza la unión intermolecular de un pequeño RNA de 39 nucleótidos  (denominado SL por "spliced leader") a la región 5' de todos los mRNAs. El trans-splicing cumple dos funciones principales: disecta los mRNAs de los policistrones y agrega el “cap”, requerido para la traducción de los mRNAs, presente en el 5’ del SL. Algunos mRNAs son procesados constitutivamente muy lentamente o ineficientemente, mientras que otros mRNAs muestran un procesamiento regulado mediante RNA binding proteins. Es interesante destacar que trans-splicing alternativo también ha sido descripto en un número considerable de genes de Tripanosomátidos. En los Tripanosomátidos se han identificado varios factores de splicing, entre ellos varias proteínas que contienen dominios RS (proteínas SR o SR-relacionadas) en T. brucei y en T. cruzi que podrían estar involucradas en la regulación del splicing.

La transcripción en estos organismos también es bastante atípica. Por ejemplo, en T. brucei la RNA pol I, además de transcribir los genes que codifican los RNAs ribosomales, también transcribe 2 grupos de genes esenciales que codifican proteínas de la superficie celular: i) Las prociclinas, que son las principales proteínas de superficie del estadio procíclico (estadio presente en el intestino del vector) y ii)  las VSG (Variant Surface Glycoproteins) proteínas principales del estadio sanguíneo replicativo presente en el huésped mamífero.  Por otra parte, la RNA pol II transcribe 2 grupos de genes distintos: i) los genes que codifican los SL-RNAs a partir de promotores RNA pol II bien definidos. Este RNA codifica  un pequeño RNA de 39 nucleótidos (denominado SL por "spliced leader") el que es transferido a la región 5' de todos los mRNA y ii) los genes que codifican por proteínas (con excepción de las prociclinas, VSGs y proteínas asociadas a las VSGs, ya que estas últimas están  presentes en el mismo policistrón que las VSGs).

Los genes que codifican proteínas están organizados en largos policistrones delimitados principalmente por marcas epigenéticas y variantes de histonas específicas (ver Fig. 1). A diferencia del resto de los eucariotas, las regiones promotoras de los policistrones transcriptos por la RNA pol II  están débilmente definidas, donde no es posible identificar elementos típicos de promotores eucariotas. La falta de promotores típicos para la RNA pol II y el enriquecimiento de variantes de histonas y modificaciones específicas de las histonas H3 y H4, presentes en las regiones de inicio y finalización de la transcripción (ver Fig. 1), sugieren que los mecanismos de control epigenético juegan un rol esencial en la modulación de la transcripción en estos organismos.

Fig 1 from The epigenome of Trypanosoma brucei- A regulatory interface to an unconventional transcriptional machine.jpg

Fig. 1: Marcas epigenéticas delimitan las unidades transcripcionales y regulan la expresión génica en T. brucei. La Transcripción mediada por la RNA pol II se inicia en promotores débilmente definidos en regiones de transcripción divergente (SSR, Strand Switch Region) y en regiones internas. La transcripción termina en regiones denominadas TTS (Transcription Termination Sites). Los sitios de inicio y terminación de la transcripción están determinados por variantes de histonas y modificaciones postraduccionales específicas de cada sitio. Fig. tomada de “The epigenome of Trypanosoma brucei: A regulatory interface to an unconventional transcriptional machine “.


En Trypanosomas poco es lo que se sabe sobre los mecanismos epigenéticos de regulación de la expresión génica. Probablemente los genes mejor estudiados y donde el conocimiento ha avanzado considerablemente en los últimos años son los que codifican por las VSGs (Variant Surface Glycoproteins), involucradas en el mecanismos de variación antigénica en T. brucei. De un repertorio de más de 1000 genes solo uno es expresado en un determinado momento. Existen aproximadamente 15 policistrones, relativamente pequeños, localizados en regiones subteloméricas que contienen a las VSGs que pueden ser transcriptas a partir de promotores RNA pol I. Estos policistrones son denominados ES por “Expression Sites” de los cuales solo uno es activo, el resto es silenciado. La represión de la transcripción en los ES silenciados probablemente opera al menos a 3 niveles: i) vía la heterocromatinización de la región ya que los ESs están cercanos a los telómeros y la heterocromatinización de las regiones subteloméricas es un fenómeno ya descripto en otros eucariotas. En línea con esto, se han identificado varios represores teloméricos presentes en las regiones de los ES;  ii) via factores que reprimen la transcripción de los promotores de los ESs inactivos y iii) mediante proteínas regulatorias o modificadoras de la estructura de la cromatina no presentes en los telómeros. De acuerdo con esto, se ha visto que que solamente el ES activo está depletado de nucleosomas.

Hasta ahora han sido identificados varios reguladores  que intervienen en el silenciamiento de los ESs. Entre ellos, la histona trimetil transferasa DOT1B que actúa sobre la H3K76, las histona deacetilasas DAC1 y DAC3 y las proteínas de unión a lisinas acetiladas BDF2 y BDF3.  También se ha demostrado que una base modificada denominada “base J”, específica del estadio sanguíneo, está presente en los ES inactivos. Sin embargo, poco es lo que se sabe sobre los mecanismos que participan en la activación específica de un ES, aunque recientemente se han identificado algunos factores que estarían de alguna manera implicados en su activación. La proteína TDP1 aparentemente substituiria histonas, facilitando de esta manera la transcripción dependiente de la RNA pol I de los genes que codifican los RNA ribosomales y del ES activo. Recientes evidencias sugieren que TDP1 excluye los nucleosomas y mantiene una cromatina abierta en el ES activo.

Si bien se ha avanzado en el conocimiento sobre la activación/represión de la expresión de las VSGs, la cual es mediada por la RNA pol I a partir de promotores definidos, es muy poco lo que se conoce sobre la regulación de la transcripción en los policistrones transcriptos por la RNA pol II. El consenso general es que la transcripción en estos policistrones no sería regulada ya que los mismos contienen genes que se expresan en diferentes estadios. Sin embargo, podrían existir mecanismos regulatorios que inhiban la transcripción globalmente. Por ejemplo, la forma sanguínea de T. brucei denominada “stumpy” esta pre-adaptada para la diferenciación al estadio procíclico, es decir, para la infección y supervivencia en el insecto vector. Este estadio está arrestado en su ciclo celular y su nivel de transcripción global está significativamente disminuido. Por otra parte, la exposición  de los parásitos a determinados estreses, como “heat shock” reduce significativamente el nivel de transcripción. Recientes resultados obtenidos por el grupo de Roditi y el nuestro, sugieren que la proteínas TbRRM1 estaría implicada en la regulación de la transcripción mediada por la RNA pol II y en el remodelado de la cromatina. La depleción de la proteína reduce significativamente la transcripción y concomitantemente hay un aumento de la  compactación de la cromatina en determinados policistrones.

Objetivos

En nuestro laboratorio, estudiamos la regulación de la expresión génica en trypanosomátidos, principalmente en Trypanosoma brucei y T. cruzi, siendo el enfoque principal en la regulación de la expresión génica mediada por RNA binding proteins. En particular nos hemos enfocado en determinar la función de de las proteínas ortólogas TcSR62 y TbRRM1 de Trypanosoma cruzi y  T. brucei respectivamente.

TbRRM1 (Tb927.2.4710) de  T. brucei y su ortóloga en T. cruzi (TcSR62, TcCLB.511621.50) son proteínas de unión a RNA que pertenecen al grupo  de las proteínas SR-relacionadas presentando una estructura modular compuesta por 3 dominios RRM (RNA Recognition Motif) en la región amino, seguido de 2 motivos dedos de Zinc y un complejo dominio en la región carboxilo compuesta a su vez de una región rica en dipéptidos (Asp/Glu)-Arg conformando una región de cargas positivas y negativas alternantes que se asemeja a los dominios RS de las proteínas SR, y un pequeño dominio RS muy cercano al carboxilo terminal de la proteína (Fig. 2). Ambas proteínas presentan entre sí una homología del 70% y una identidad del 55%.


Fig. 2: Esquema de los dominios las proteínas TbRRM1/TcSR62.


Resultados previos de nuestro grupo relacionados con el estudio de estas proteínas han sido publicados en los siguientes trabajos:

  • Nucleolar Localization of RNA Binding Proteins Induced by Actinomycin D and Heat Shock in Trypanosoma cruzi.   Ezequiel Názer, Ramiro E. Verdún, Daniel O. Sánchez. PLoS ONE 6(5): e19920. doi:10.1371/journal.pone.0019920 (2011).


  • Nucleolar Accumulation of RNA Binding Proteins Induced by Actinomycin D Is Functional in Trypanosoma cruzi and Leishmania mexicana but Not in T. brucei.  Ezequiel Názer and Daniel O. Sánchez.    PLoS ONE 6(8): e24184. doi:10.1371/journal.pone.0024184 (2011).

  • Severe Heat Shock Induces Nucleolar Accumulation of mRNAs in Trypanosoma cruzi. Ezequiel Názer, Ramiro E. Verdún, Daniel O. Sánchez    PLoS ONE 7(8): e43715. doi:10.1371/journal.pone.0043715 (2012).

  • Depletion of the SR-Related Protein TbRRM1 Leads to Cell Cycle Arrest and Apoptosis-Like Death in Trypanosoma brucei.    Levy GV, Bañuelos CP, Níttolo AG, Ortiz GE, Mendiondo N, Moretti G, Tekiel VS, Sánchez DO. PLoS One. 2015 10(8):e0136070. doi: 10.1371/journal.pone.0136070.


Actualmente nuestro grupo está enfocado en la caracterización funcional de la RNA binding protein TbRRM1. Se resumen a continuación los resultados obtenidos recientemente:

TbRRM1 silencing downregulates transcription

Run-on experiments assayed by FACS after 24 h silencing of TbRRM1. Percentage of BrU incorporation by parasites grown in absence (TET-) or presence (TET+) of tetracycline. Error bars indicate the standard deviations around the mean from three independent experiments for Act-D- or two for Act-D+. Data were analyzed by one sample Student t test. *p<0.05, **p<0.01.



Schematic portion of chromosome 9 containing the PTU-TbNOP86 and ChIP-Seq data of histone H2AZ, H2BV and H4K10ac enrichment regions.

Histone ChIP-seq data were obtained from Prof. Nicolai Siegel ́s Laboratory. The position of each gene/Intergenic Region (IR) is represented by coloured boxes in the upper scheme and below by the continuous vertical lines. Note the location of the histone peaks, which indicate the possible Transcription Start Sites. The upper coloured arrows show the divergent Strand Switch Region (dSSR) and the direction of transcription. The relative number of tags for the three histones was calculated for a window size of 100 bp.


TbRRM1 silencing leads to transcriptional downregulation of genes located within the PTU-TbNOP86


Analysis of transcription and RNA levels in the PTU-TbNOP86 after TbRRM1 silencing. (a) Run-on experiments. The level of transcription was analyzed by RTqPCR on biotin labeled RNA. (b) RNA steady-state levels of the regions shown in (a). (c) Run-on analysis of genes transcribed by different polymerases. (d) RNA levels of the same genes analyzed in (c). The bars indicate the average of at least three independent biological replicates ± standard deviation. Data were analyzed by one sample two-tailed Student t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

TbRRM1 binds to chromatin and is involved in chromatin remodeling

(a) Chromatin structure analysis along the PTU-TbNOP86 in control (TET-) and in TbRRM1 depleted cells (TET+) by the FAIRE technique. (b) FAIRE analysis in genomic regions transcribed by different polymerases. Data from FAIRE were analyzed by one sample two-tailed Student t-test. (c) Distribution of TbRRM1 determined by chromatin immunoprecipitation (ChIP) over selected regions of the PTU-TbNOP86 (d) ChIP assay of the same genes analyzed in (b). Gray overlapped bars show non-specific binding (pre-immune mouse serum) for each amplicon. The bars indicate the average of at least three independent biological replicates ± standard deviation. Data from TbRRM1-ChIP were analyzed by two-tailed Student t-test comparing to serum control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.





Colaboraciones actuales
  • Dra Valeria Tekiel (IIB-UNSAM).
  • Dr. Fernán Agüero (IIB-UNSAM).
  • Dr. Rolando Rivera Pomar. Centro Regional de Estudios Genómicos (CREG). Universidad Nacional de La Plata. La Plata, Argentina
  • Dr Esteban Erben. Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg (ZMBH), D69120 Heidelberg, Germany.
Publicaciones 2005-2018
The protein family TcTASV-C is a novel Trypanosoma cruzi virulence factor secreted in extracellular vesicles by trypomastigotes and highly expressed in bloodstream forms.
Lucas D. Caeiro; Catalina Dirney Alba-Soto; Mariana Rizzi; Giselle Rodriguez; Agustina M. Chidichimo; Matías Exequiel Rodriguez; Daniel O. Sánchez; Gabriela V. Levy; Valeria Tekiel.  
    PLOS Neglected Tropical Diseases. 2018 (en prensa)


The TcTASV proteins are novel promising antigens to detect active Trypanosoma cruzi infection in dogs.

Floridia-Yapur N, Monje Rumi M, Ragone P, Lauthier JJ, Tomasini N, Alberti D’Amato A, Diosque P, Cimino R, Marco D, Barroso P, Sanchez DO, Nasser JR, Tekiel V.
            Parasitology. 2016. 143 (11): 1382-9. doi: 10.1017/S0031182016000822. 
            [PubMed Abstract]
Depletion of the SR-Related Protein TbRRM1 Leads to Cell Cycle Arrest and Apoptosis-Like Death in Trypanosoma brucei.

Levy GV, Bañuelos CP, Níttolo AG, Ortiz GE, Mendiondo N, Moretti G, Tekiel VS, Sánchez DO.
PLoS One. 2015 10(8):e0136070. doi: 10.1371/journal.pone.0136070.
[ Open Access]


   
TcTASV-C, a protein family in Trypanosoma cruzi that is predominantly trypomastigote-stage specific and secreted to the medium.

Bernabó G, Levy G, Ziliani M, Caeiro LD, Sánchez DO, Tekiel V.

          PLoS ONE 8(7): e71192. doi:10.1371/journal.pone.0071192 (2013)


[ Open Access ]



A genomic scale map of genetic diversity in Trypanosoma cruzi.


Alejandro A Ackermann, Leonardo G Panunzi, Raul O Cosentino, Daniel O Sánchez and Fernán Agüero
BMC Genomics 13:736 (2012). doi:10.1186/1471-2164-13-736.


[Free Full Text]

[Pub Med abstract]



Severe Heat Shock Induces Nucleolar Accumulation of mRNAs in Trypanosoma cruzi.


Ezequiel Názer, Ramiro E. Verdún, Daniel O. Sánchez

PLoS ONE 7(8): e43715. doi:10.1371/journal.pone.0043715 (2012).

[Open access]


Nucleolar Accumulation of RNA Binding Proteins Induced by Actinomycin D Is Functional in Trypanosoma cruzi and Leishmania mexicana but Not in T. brucei.
        Názer, E. and Sánchez, D.O.
PLoS ONE 6(8): 6(8): e24184. doi:10.1371/journal.pone.0024184 (2011)

Nucleolar Localization of RNA Binding Proteins Induced by Actinomycin D and Heat Shock in Trypanosoma cruzi.
Názer, E., Verdún, R.E. and Sánchez, D.O.
PLoS ONE 6(5): e19920. doi:10.1371/journal.pone.0019920 (2011)

Gene discovery in Triatoma infestans. 
Maria L Avila, Valeria Tekiel, Georgina Moretti, Soledad Nicosia, Jacqueline Bua, Estela M Lammel, Maria M Stroppa, Nelia M Gerez de Burgos and Daniel O Sanchez.
Parasites & Vectors 2011, 4:39 (18 March 2011)

TcTASV: a novel protein family in Trypanosoma cruzi identified from a subtractive trypomastigote cDNA library.
García EA, Ziliani M, Agüero F, Bernabó G, Sánchez DO, Tekiel V.
PLoS Negl Trop Dis. 2010 Oct 5;4(10). pii: e841.PMID: 20957201


Genomic Analysis of Campylobacter fetus Subspecies: Identification of Candidate Virulence Determinants and Diagnostic Assay Targets.
Paula M Moolhuijzen, Ala E Lew-Tabor, Bartosz M Wlodek, Fernán G Agüero, Diego J Comerci, Rodolfo A Ugalde, Daniel O Sanchez, Rudi Appels and Matthew Bellgard
BMC Microbiology, 9: 86 (2009)

Identification of novel vaccine candidates for Chagas' disease by immunization with sequential fractions of a trypomastigote cDNA expression library. 
Valeria Tekiel, Catalina Alba-Soto, Stella M. González Cappa, Miriam Postan and Daniel O. Sánchez
Vaccine. 27(9):1323-32 (2009)

Two simultaneous hepatitis B virus (HBV) epidemics among injecting drug users and men who have sex with men in Buenos Aires, Argentina: characterization of the first D/A recombinant from the American continent.
Julieta Trinks, María L. Cuestas, Yasuhito Tanaka, Verónica L. Mathet, María L. Minassian, Cintia W. Rivero, Jorge A. Benetucci, Edgardo D. Gímenez, Marcela Segura, María C. Bobillo, Daniel Corach, P. Daniel Ghiringhelli, Daniel O. Sánchez, María M. ávila, Liliana A. Martínez Peralta, Fuat Kurbanov, Mercedes C. Weissenbacher, Peter Simmonds, Masashi Mizokami and José R. Oubiña.
Journal of Viral Hepatitis. 15(11): 827-838 (2008).

The Calcineurin A homologue from Trypanosoma cruzi lacks two important regulatory domains.
Moreno VR, Agüero F, Tekiel V, Sánchez DO.
Acta Trop. 101: 80-89 (2007).

Dynamics of a hepatitis B virus e antigen minus population ascribed to genotype F during the course of a chronic infection despite the presence of anti-HBs antibodies.
V.L. Mathet, J.L. López, V. Ruiz, D.O. Sánchez, G. Carballal, R.H. Campos, J.R. Oubiña.
Virus Research 123: 72-85 (2006).

Metacaspases of Trypanosoma cruzi: Possible candidates for programmed cell death mediators.
Kosec G, Alvarez VE, Aguero F, Sánchez D, Dolinar M, Turk B, Turk V, Cazzulo JJ.
Mol Biochem Parasitol 145(1): 18-28 (2006).

The Genome Sequence of Trypanosoma cruzi, Etiologic Agent of Chagas Disease
Najib M.A. El-Sayed, Peter J. Myler, Daniella C. Bartholomeu, Daniel Nilsson, Gautam Aggarwal, Anh-Nhi Tran, Elodie Ghedin, Elizabeth A. Worthey, Arthur L. Delcher, Galle Blandin, Scott J. Westenberger, Elisabet Caler, Gustavo Cerqueira, Carole Branche, Brian Haas, Atashi Anapuma, Erik Arner, Lena Aslund, Philip Attipoe, Esteban Bontempi, Frdric Bringaud, Peter Burton, Eithon Cadag, David A. Campbel, Mark Carrington, Jonathan Crabtree, Hamid Darban, Jose Franco da Silveira, Pieter de Jong, Kimberly Edwards, Paul T. Englund, Gholam Fazelina, Tamara Feldblyum, Marcela Ferella, Alberto Carlos Frasch, Keith Gull, David Horn, Yiting Huang, Ellen Kindlund, Michele Klingbeil, Sindy Kluge, Hean Koo, Daniela Lacerda, Mariano J. Levin, Hernan Lorenzi, Tin Louie, Carlos Renato Machado, Richard McCulloch, Alan McKenna, Yumi Mizuno, Jeremy C. Mottram, Siri Nelson, Stephen Ochaya, Kazutoyo Osoegawa, Grace Pai, Marilyn Parsons, Martin Pentony, Ulf Pettersson, Mihai Pop, Jose Luis Ramirez, Joel Rinta, Laura Robertson, Steven L. Salzberg, Daniel O. Sanchez, Amber Seyler, Reuben Sharma, Anjana J. Simpson, Ellen Sisk, Martti T. Tammi, Rick Tarleton, Santuza Teixeira, Susan Van Aken, Christy Vogt, Pauline Ward, Bill Wickstead, Jennifer Wortman, Owen White, Claire M. Fraser, Kenneth D. Stuart & Bjorn Andersson.
Science. 309(5733): 409-15 (2005).

Characterization of Farnesylated Protein Tyrosine Phosphatase TcPRL-1 from Trypanosoma cruzi
Ileana C. Cuevas, Peter Rohloff, Daniel O. Sánchez, and Roberto Docampo.
Eukaryotic Cell 9(4): 1550-1561 (2005)

Chagas' disease: TCRBV9 over-representation and sequence oligoclonality in the fine specificity of T lymphocytes in target tissues of damage.
Valeria Tekiel, Guilherme C. Oliveira, R. Correa-Oliveira, D. Sánchez, S. M. González-Cappa.
Acta Tropica 94: 15-24 (2005).

Subsidios Actuales
  • PICT-2014-0395: "Identificación de proteínas asociadas a la proteína de unión a RNA TbRRM1 de Trypanosoma brucei".
  • PICT-2014-0879: " Identificación de los genes regulados por la proteína de unión a RNA TbRRM1 de Trypanosoma brucei".

Fecha de la última actualización: 24 abril 2018