五、仿生物催化奈米酵素於環境及生物檢測應用

我們以金屬離子 (Pt⁴⁺/Pb²⁺和Bi³⁺/Hg²⁺) 當作輸入，Au NPs酵素 [過氧化酶 (peroxidase, POX)]活性當做輸出，可構建出AND和INHIBIT邏輯閘 (logic gate)，藉由所建構出的邏輯閘 [Pt⁴⁺/Pb²⁺(AND)−Au NP_POX和Bi³⁺/Hg²⁺(INHIBIT)−Au NP_POX]可分別選擇性偵測水樣中的Pb²⁺和Hg²⁺，且可用構建出邏輯電路以產生氧氣氣泡 (含Hg²⁺) 和紅色試鹵靈 [resorufin；辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase, HRP) 基質Amplex Red (AR) 氧化後的產物] (含Pb²⁺)的方式用視覺分別辨識水樣中含有Hg²⁺或Pb²⁺。另外，修飾上Ag NPs和Au NPs的陽極氧化鈦 (anodic titanium oxide, ATO) 具有更佳的吸光度，且提供好的催化光解效率可用於殺菌使用，相較於沒有照紫外光的對照組 (10⁶ CFU/mL)，照紫外光的E. coli存活率變成10² CFU/mL。接著，利用Te NTs和Ag⁺和Au³⁺進行galvanic replacement reaction合成Au/Ag−Te NSs (NSs: nanostructures)，具有相當高的oxidase催化活性，能轉變沒有螢光的AR，形成有螢光產物resorufin，且能產生活性氧物質 (reactive oxygen species, ROS)，可用於殺菌 (大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌)，並結合魔芋果凍膜 (konjac jelly film)，製成傷口敷料來減少細菌傷口感染。近期，我們以非晶相氫氧化/氧化鐵固定在還原型氧化石墨烯 (iron hydroxide/oxide immobilized on reduced graphene oxide, FeO_xH–rGO) 上和非晶相氫氧化/氧化鈷修飾在氧化石墨烯 (cobalt hydroxide/oxide modified graphene oxide, CoO_xH-GO)的奈米複合材料，這兩種材料都具有高的peroxidase活性，分別加入硫離子 (S²⁻) 和氰離子 (CN⁻) 後會分別形成FeS在FeO_xH–rGO奈米複合材料表面上或是鈷-氰複合物 [Co(II)-cyanide complex; β₄ (Co(CN)₄^2-) ~ 1.16 ´ 10³¹ M^-4] 而使CoO_xH從CoO_xH-GO表面上脫離，使得peroxidase活性下降，藉此可用於水樣中的S²⁻ (偵測極限為50 nM) 和CN⁻偵測 (偵測極限為22 nM)。特別的是CoO_xH-GO可用於偵測複雜的實驗廢液中的CN⁻偵測，結合帶正電的多孔尼龍膜 (positively charged and porous nylon membrane, N⁺M) 後製成的薄膜 (CoO_xH-GO/N⁺M)，結合AR和H₂O₂的H₂O₂/AR–CoO_xH-GO/N⁺M探針可用視覺辨識於實驗廢液中CN⁻偵測 (紅色越淡代表CN⁻濃度越高)。

我們合成具有peroxidase活性的適合體修飾金奈米粒子結合到BiOCl所製備的複合奈米材料 (Apt–AuNPs/BiOCl)，加入VEGF後，Apt–AuNPs/BiOCl的peroxidase活性下降，藉此可用於VEGF偵測。接著以aptamer包覆銅奈米粒子 (TBA₂₉-T_n–CuO/Cu₂O NPs)，其具有peroxidase活性，並發現TBA₂₉-T_n–CuO/Cu₂O和thrombin結合後使催化活性下降，利用此特性應用於檢測thrombin，可在血清環境下進行蛋白選擇性偵測實驗，偵測極限達0.5 nM，且可應用於不同aptamer系統，如合成Apt_MUC1-T₃₀–CuO/Cu₂O NPs可以用於檢測MUC1蛋白表現之癌細胞。接著我們分別合成具有oxidase活性之金奈米粒子到鉍氧化碘奈米網絡 (gold nanoparticles/bismuth oxyiodide nanonetworks, Au NPs/BiOI) 和peroxidase活性之氧化鎳奈米粒子到鉍氧化碘奈米網絡 (nickel oxide nanoparticles/bismuth oxyiodide nanonetworks, NiO NPs/BiOI)，加入Hg²⁺和Pb²⁺後會分別抑制酵素活性，以達到選擇性偵測水樣中的Hg²⁺和Pb²⁺。進一步我們將具有高oxidase活性的金鉍氧化碘奈米複合物 (gold-doped bismuth oxyiodide nanocomposites, Au/BiOI nanocomposites)用做抗菌劑，並證明Au/BiOI nanocomposites會破壞細菌膜的完整性和生成ROS來殺菌。最後我們利用細菌性角膜炎的兔子證明Au/BiOI nanocomposites會緩解角膜細菌感染而不引起炎症組織反應(包括角膜和結膜水腫，虹膜炎和充血)，此結果表明Au/BiOI nanocomposites作為抗菌劑具有巨大的潛力。我們亦發現氧化銅奈米複合物(Copper oxide composite)吸附不同金屬離子能使得其具有不同催化活性，尤其搭配Pt離子合成之T₆₀-Cu_xO/Pt NCs，具有優秀的oxidase活性。然而此oxidase活性在處於有機汞的環境下會被抑制，搭配ABTS這系統能檢測樣品中是否含有有機汞。我們亦發現外加銫奈米粒子，能有效增加T₆₀-Cu_xO/Pt NCs對於甲基汞的專一性，並有效地應用於真實魚組織樣品的檢測。

我們成功合成出具有仿過氧化酶活性的銀-金/氯化銀奈米複合物 (Ag-Au/AgCl nanohybrid)，能催化AR和H₂O₂反應產生紅色螢光的試鹵靈 (resorufin)，在有精胺 (spermine，一種癌症標誌物)，導致仿過氧化酶活性下降 (產生紅色且有紅色螢光的resorufin會下降)，所以可用螢光下降幅度來偵測spermine。且H₂O₂/AR–Ag-Au/AgCl nanohybrid具有很高的選擇性和容忍度來測spermine，LOD能達到0.87 nM，且在尿液樣品中測spermine，所得的結果和HRP/AR-SMO方法有很高相關性，證明我們的assay能在尿液樣品中測spermine。

(1) C.-W. Lien, Y.-T. Tseng, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Anal. Chem. 2014, 86, 2065–2072.

(2) H.-H. Chiang, S.-H. Wang*, H.-Y. Chou, C.-C. Huang, T.-L. Tsai, Y.-C. Yang, J.-W. Lee, T.-Y. Lin, Y.-J. Wu and C.-C. Chen, J. Mar. Sci. Tech. 2014, 22, 269–276.

(3) H.-Y. Chang, J. Cang, P. Roy, H.-T. Chang*, Y.-C. Huang and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 8305–8312.

(4) K.-I. Hsu, C.-W. Lien, C.-H. Lin, H.-T. Chang* and C.-C. Huang*, RSC Adv. 2014, 4, 37705–37713.

(5) C.-L. Hsu, C.-W. Lien, C.-W. Wang, S. G. Harroun, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Biosens. Bioelectron. 2016, 75, 181–187.

(6) C.-W. Wu, S. G. Harroun, C.-W. Lien, H.-T. Chang, B. Unnikrishnan, I. P.-J. Lai, J.-Y. Chang and C.-C. Huang*, Sens. Actuators, B Chem. 2016, 227, 100–107.

(7) C.-L. Hsu, C.-W. Lien, S. G. Harroun, R. Ravindranath, H.-T. Chang*, J.-Y. Mao and C.-C. Huang*, Mater. Chem. Front. 2017, 1, 893–899.

(8) C.-W. Lien, B. Unnikrishnan, S. G. Harroun, C.-M. Wang, J.-Y. Chang, H.-T. Chang* and C.-C. Huang*, Biosens. Bioelectron. 2018, 102, 510–517.

(9) P.-C. Kuo, C.-W. Lien, J.-Y. Mao, B. Unnikrishnan, H.-T. Chang, H.-J. Lin* and C.-C. Huang*, Anal. Chim. Acta 2018, 1009, 89–97.

(10) C.-L. Hsu, Y.-J. Li, H.-J. Jian, S. G. Harroun, S.-C. Wei, R. Ravindranath, J.-Y. Lai*, C.-C. Huang and H.-T. Chang*, Nanoscale 2018, 10, 11808–11819.

(11) C.-W. Lien, P.-H. Yu, H.-T. Chang, P.-H. Hsu, T. Wu, Y.-W. Lin*, C.-C. Huang and J.-Y. Lai*, Anal. Chim. Acta, 2019, 1084, 106–115.

在我們過去研究中知道可利用奈米材料搭配上不同金屬離子，會誘導出不同酵素活性 (peroxidase、oxidase或catalase)，可用於抑菌、檢測陰離子或重金屬離子或是生物性樣品，不過這些材料很容易會受到生物環境干擾 (如蛋白質)，使其活性下降，未來希望能合成在生物環境下仍具有高酵素活性的奈米複合材料，並結合辨識性分子後可更有效用於不同的生物性應用。