四、質譜應用於生物檢測與奈米粒子分析

在雷射脫附游離質譜 (laser desorption/ionization mass spectrometry, LDI-MS) 研究中發現，奈米粒子經由脈衝雷射擊打後能進行脫附游離，並可於質譜儀中觀察到奈米團簇 (nanoclusters) 離子的訊號，此技術可應用於定性和定量奈米粒子表面組成，也可進一步鑑定其表面鍵結分子，並應用於奈米薄膜感測器之開發。在蛋白質的檢測上，將Apt−Au NPs/NCM並與thrombin反應後，觀察經雷射擊打後所游離出之Au團簇訊號變化，定量血清中thrombin濃度。而後，藉由Au NPs上修飾不同長度及密度的帶有巰基官能基DNA (SH-DNA)，觀察Au clusters之訊號改變，提供第一個藉由LDI-MS分析修飾在Au NPs材料上的DNA結構與覆蓋率。另外，我們用汞碲奈米結構基質 (HgTe nanostructure-based matrices, HgTe NMs) 取代LDI-MS分析中傳統的有機基質，可有效分析到聚乙二醇 (polyethylene glycol) 分子量42,000 Da的訊號，且可分析到生物素-聚乙二醇修飾的Au NPs (biotin-polyethylene glycol-Au NPs) 和抗生物素蛋白 (avidin)結合後的訊號。近期，我們利用合成出的汞碲奈米結構基質 (HgTe nanostructure-based matrices, HgTe NMs)、汞硒奈米結構基質 (HgSe nanostructure-based matrices, HgSe NMs) 和汞碲硒奈米結構基質 (HgTeSe nanostructure-based matrices, HgTeSe NMs) 結合LDI-MS，可分析不同的藻類。接著，我們利用掌性的 (chirality) 半胱氨酸 (cysteine, Cys)如D-Cys和L-Cys當作配體 (ligand)，加入金離子 (Au³⁺)和硼氫化鈉 (sodium borohydride, NaBH₄)後可分別合成出chirality的金奈米團簇超分子 (Au NCs/−[D-Cys−Au(I)]_n−和 AuNCs/−[L-Cys−Au(I)]_n−supramolecules)，搭配LDI-MS後，可分別用來選擇性偵測L型肉鹼 (L-carnitine)和D型肉鹼 (D-carnitine)。

於生物檢測方面。將R6G修飾在GO後形成R6G−GO基質，當加入單鏈DNA (single-stranded DNA, ssDNA) 後，以LDI-MS偵測其R6G的訊號會上升，故可進行ssDNA之分析。我們進一步結合探針DNA (probe DNA) 和外切酶III (exonuclease III, Exo III)，當目標miRNA加入時，probe DNA和miRNA互補反應，再經由Exo III消化 (digest) 作用後，最終以LDI-MS分析時藉由偵測到的R6G訊號上升，可間接偵測樣品中miRNA濃度，LOD可達fM等級。我們亦利用Pb⁺/Au NPs/MCEM系統搭配上LDI-MS，開發出亞砷酸根離子 (AsO₂⁻)之檢測方法，並利用質譜分析，以[Pb]⁺/[Au]⁺訊號比值定量AsO₂⁻濃度，LOD可達2.5 nM，此LOD遠低於美國環境衛生署 (US EPA) 對於飲用水的標準，同時此系統也被證明可以在真實水樣品中 (自來水、地表水和礦泉水等) 偵測AsO₂⁻。另外，我們亦可利用未修飾之薄膜應用於Pb²⁺檢測，可成功於真實水樣 (如自來水、地表水和礦泉水等)及吸管等樣品中檢測Pb²⁺濃度，LOD可達pM。我們通過監測金屬簇離子的產生，開發了一種通過功能化奈米材料於醋酸纖維素膜 (cellulose acetate membrane, CAM) 與LDI-MS檢測蛋白質的檢測方法。我們通過修飾適合體 (aptamer) 或抗體 (antibody) 於三種不同金屬 (Au、Ag和Pt) 的奈米粒子後，在修飾於CAM製成薄膜，分別由金屬團簇離子的訊號，來選擇性檢測三種蛋白質如凝血酶 (thrombin)、血管內皮生長因子-_A165 (vascular endothelial growth factor-_A165, VEGF-_A165) 和血小板衍生生長因子-BB (platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)。我們亦利用多種金屬奈米粒子(Au, Ag NPs)搭配EV71, ZIKV, JEV抗體，利用三明治免疫分析法，做到2種病毒顆粒之共同檢測。

在癌細胞偵測方面，以Apt_MUC1修飾Au NPs (Apt_MUC1-Au NPs)，再修飾於GO表面 (Apt_MUC1-Au NPs/GO)，藉由LDI-MS所得到質譜圖上金奈米團簇訊號來偵測癌症細胞數量並可用於癌組織顯影，最低可偵測到100個乳癌細胞，且可區分四種不同MUC1表現量之癌細胞。另以Apt_MUC1修飾於金奈米薄膜 (gold nanofilms, Au NFs) 的Apt_MUC1-Au NFs，藉由癌細胞結合Apt_MUC1-Au NFs上抑制金奈米團簇訊號，來推算癌細胞之數量，最低可偵測10個癌細胞。之後，我們利用聚兒茶素所合成的金奈米粒子 [poly(catechin) capped-gold NPs, Au@PC NPs]和核仁素 (nucleolin) 結合適合體 (AS1411) 修飾之金奈米粒子組成衛星般的金奈米複合材料 (satellite-like gold nanocomposites)，結合LDI-MS，利用監控金團簇訊號組成影像，可以選擇性標誌出核仁素表現之癌細胞在組織中的位置。

於CQD結構分析方面，我們用檸檬酸 (citric acid) 檸檬酸二銨 (diammonium citrate) 所燒製成的CQD (分別是CA-CQD和AC-CQD) 在LDI-MS中雷射燒蝕後所產生的團簇離子訊號 ([C_n]^– ( n = 4−9)、[CNO]⁻、[CH₃N₂O₃]⁻、[CH₃N₂O₄]⁻)能用來分析其CQD的結構。而用亞精胺三鹽酸鹽 (spermidine trihydrochloride) 所燒製成的CQD (Spd-CQDs) 在LDI-MS中雷射燒蝕後所產生的團簇離子訊號是沒有看到[C_n]^– ( n = 4−9) 而是觀察到強的氯相關離子團簇訊號，可能是由於二級胺鎖定在亞精胺的碳主鏈上以及CQD的核和表面中存在的高含量氯 (約有28%)。我們希望這些發現有助於對CQDs的理解和分析，並為CQD衍生物的結構分析提供新的方法。另外，我們製備了氧化石墨烯奈米片修飾的帶正電的多孔尼龍膜 (positively charged and porous nylon membrane, N⁺M) 後製成的薄膜 (graphene oxide nanosheet-modified N⁺-nylon membrane; GOM) 並將其用作提取和噴霧電離的基質並結合質譜後稱為氧化石墨烯膜噴霧質譜法 (GOM spray-mass spectrometry, GOMS-MS)，可在鯉魚樣品中檢測孔雀石綠 (malachite green) 的LOD達到 0.65 mg kg^-1。

(1) C.-I. Weng, J.-S. Cang, J.-Y. Chang, T.-M. Hsiung, B. Unnikrishnan, Y.-L. Hung, Y.-T. Tseng, Y.-J. Li, Y.-W. Shen and C.-C. Huang*, Anal. Chem. 2014, 86, 3167–3173.

(2) H.-Y. Wu, B. Unnikrishnan and C.-C. Huang*, Sens. Actuators, B Chem. 2014, 203, 880–886.

(3) Y.-J. Li, W.-J. Chiu, B. Unnikrishnan and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 15253–15261.

(4) R.-C. Huang, W.-J. Chiu, Y.-J. Li and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 21780–21787.

(5) R.-C. Huang, W.-J. Chiu, I. P.-J. Lai and C.-C. Huang*, Sci. Rep. 2015, 5, 10292.

(6) W.-J. Chiu, T.-K. Ling, H.-P. Chiang, H.-J. Lin and C.-C. Huang*, ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 8622–8630.

(7) H.-Y. Chang, M.-F. Huang, C.-L. Hsu, C.-C. Huang* and H.-T. Chang*, Colloids Surf. B 2015, 130, 157–163.

(8) L.-H. Peng, B. Unnikrishnan, C.-Y. Shih, T.-M. Hsiung, J. Chang, P.-H. Hsu, T.-C. Chiu* and C.-C. Huang*, Mar. Biotechnol. 2016, 18, 283–292.

(9) B. Unnikrishnan, C.-Y. Chang, H.-W. Chu, A. Anand and C.-C. Huang*, Anal. Methods 2016, 8, 8123–8133.

(10) C.-Y. Chang, H.-W. Chu, B. Unnikrishnan, L.-H. Peng, J. Cang, P.-H. Hsu* and C.-C. Huang*, APL Mater. 2017, 5, 053403.

(11) Y.-T. Tseng, S. G. Harroun, C.-W. Wu, J.-Y. Mao, H.-T. Chang* and C.-C. Huang*, Nanotheranostics 2017, 1, 141–153.

(12) H.-W. Chu, J.-Y. Mao, C.-W. Lien, P.-H. Hsu, Y.-J. Li, J.-Y. Lai, T.-C. Chiu*, and C.-C. Huang*, Nanoscale 2017, 9, 18359–18367.

(13) S.-C. Wei, S. Fan, C.-W. Lien, B. Unnikrishnan, Y.-S. Wang, H.-W. Chu, C.-C. Huang, P.-H. Hsu* and H.-T. Chang*, Anal. Chim. Acta 2018, 1003, 42–48.

(14) H.-W. Chu, B. Unnikrishnan, A. Anand, J.-Y. Mao and C.-C. Huang*, J. Food Drug Anal. 2018, 26, 1215–1228.

(15) Y.-T. Tseng, H.-Y. Chang, S. G. Harroun, C.-W. Wu, S.-C. Wei, Z. Yuan, H.-L. Chou*, C.-H. Chen, C.-C. Huang* and H.-T Chang*, Anal. Chem_. 2018, 90, 7283–7291.

(16) H.-W. Chu, C.-S. Lai, J.-Y. Ko, S. G. Harroun, C.-I Chuang, R. Y. L. Wang*, B. Unnikrishnan and C.-C. Huang*, ACS Sens., 2019, 4, 1543–1551.

根據現階段之研究發現，利用修飾官能基的Au NPs製成之奈米薄膜，在LDI-MS偵測系統下，擁有較穩定的均勻度，而不修飾表面之奈米粒子直接製成之試紙薄膜後亦具有選擇性偵測陰離子、癌細胞等等，而合成的HgTe NMs雖可分析大範圍不同分子量聚合物，不過解析度和分析效率還有改善空間。在LDI-MS結合的複合性奈米材料合成時，須注意其再現性及脫附游離之效率，如何解決這些問題將是影響後續研究的門檻。