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Artículo

Detección de Salmonella en lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa

Detection of Salmonella in lettuce (Lactuca sativa L. var. Capitata) by Polymerase Chain Reaction

Cecilia Casabonne*, Sonia Tomasiello, Virginia Aquili, Agustina González, Tomás Subils, Claudia Balagué

Universidad Nacional de Rosario (UNR), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Departamento de Microbiología, Área Bacteriología. Suipacha 531, Rosario, Argentina.

*Autora para correspondencia: ccasabonne@fbioyf.unr.edu.ar

Aceptado-06-Enero-2018

Resumen

La metodología de referencia para la búsqueda de Salmonella es el cultivo tradicional, sin embargo, es una técnica laboriosa y requiere varios días de procesamiento. Los métodos genotípicos resultan una alternativa eficaz frente a esta problemática. El objetivo de este trabajo fue evaluar la Reacción en Cadena de la Polimerasa para la detección de Salmonella en muestras de lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) para su implementación en un laboratorio de microbiología de alimentos de la ciudad de Rosario, Argentina. Se empleó la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para detección del gen invA como marcador de Salmonella spp. Se realizó la validación de la técnica mediante la determinación de la inclusividad, la exclusividad y el límite de detección. El límite de detección fue de 1,0 µg/mL de ADN. La técnica presentó una inclusividad y una exclusividad del 100 % y exhibió un grado de concordancia muy bueno con respecto a la técnica de cultivo. Este trabajo permitió demostrar la factibilidad en el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa para detección de Salmonella en muestras de lechuga; sin embargo, es necesario estandarizar esta metodología de acuerdo a las condiciones de cada laboratorio y del alimento a procesar para asegurar su validez diagnóstica.

Palabras claves: invA, lechuga, RCP, Salmonella, tamizaje, validación.

Abstract

The reference methodology to investigate Salmonella is traditional culture, however, it is a laborious technique and requires several days of processing. Genotypic methods are an effective alternative to this problem. The aim of this study was to develop a Salmonella detection method based on Polimerase Chain Reaction in lettuce samples (Lactuca sativa L. var. Capitata) for its implementation in a microbiology laboratory in the city of Rosario, Argentina. The Polimerase Chain Reaction technique was used for the detection of the invA gene because it is specific to the Salmonella genus. Validation was performed by the determination of inclusivity, exclusivity, and limit of detection. The limit of detection was 1.0 µg/mL DNA. The technique presented an inclusivity and exclusivity of 100 %, and showed a very good degree of agreement with respect to the cultivation technique. This work allowed us to demonstrate the feasibility of using Polimerase Chain Reaction to detect Salmonella in lettuce samples; however, it is necessary to standardize this methodology according to the conditions of each laboratory and of the food to be processed to ensure its diagnostic validity.

Key words: invA, lettuce, PCR, Salmonella, screening, validation.

INTRODUCCIÓN

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) han sido catalogadas por expertos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el problema de salud pública más diseminado en el mundo contemporáneo. La OMS estimó que, en el año 2005, murieron aproximadamente 1,8 millones de personas debido a enfermedad diarreica asociada a la ingesta de agua o alimentos contaminados (Barrantes y Achí, 2011).

La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. La tasa de incidencia de la infección es mayor en los lactantes, en niños de corta edad y en ancianos, por lo que se la considera de alto impacto para la salud pública. La transmisión de Salmonella ocurre a través de aguas, alimentos contaminados y de persona a persona (Eley, 1994; Caffer et al., 2008).

La presencia de Salmonella en un alimento se considera peligrosa y, por lo tanto, no apto para el consumo humano. A pesar de los controles que se han puesto en práctica, las infecciones por Salmonella, debidas al consumo de alimentos contaminados, continúan siendo un problema serio con millones de casos que ocurren anualmente en todo el mundo, provocando grandes pérdidas económicas (Parra et al., 2002; Caffer et al., 2008).

En Estados Unidos, en el período 1996-2006, Salmonella fue uno de los patógenos frecuentemente relacionado con ETA. En este país, durante el 2005 y el 2006 se registraron 4 brotes por consumo de tomate, con 459 casos de salmonelosis confirmados por cultivo, mientras que en el año 2006 se registraron 121 brotes, con más de 3300 casos (Barrantes y Achí, 2011).

En Europa, entre 1990-1992, Salmonella fue responsable del 83 al 87 % de los brotes de ETA registrados. Su presencia se detectó en vegetales frescos de exportación (lechugas, mostaza, albahaca, tubérculos, entre otros), con una frecuencia de 1,9 a 8,0 % (Barrantes y Achí, 2011).

Muchos trabajos han determinado la composición proximal del pescado y los mariscos a nivel mundial. El conocimiento del aporte nutricional de las especies marinas ha sido motivo de extensos estudios en varios países. No obstante, la información acerca de los valores nutricionales y composición química de las especies que se consumen en el Costa Rica es escasa (Fonseca-Rodríguez et al., 2013).

En Argentina, entre las bacterias frecuentemente asociadas a ETA se encuentran Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Clostridium perfringens. En nuestro país, durante el período 2010-2012, en el Laboratorio Nacional de Referencia se caracterizaron y subtipificaron aislamientos relacionados con 11 brotes alimentarios causados por Salmonella spp. (64 % por Salmonella Typhimurium) (DB-INEI et al., 2012).

Por ello, la vigilancia de Salmonella spp. en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de esta enfermedad (Caffer et al., 2008).

En los programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella spp. Tradicionalmente, los métodos microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido métodos basados en el cultivo microbiológico. Puntualmente, el método tradicional de detección de Salmonella comprende 4 fases: una primera fase de pre-enriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y complejos en su procesamiento y prolongan la obtención de los resultados hasta una semana (Li y Mustapha, 2004; Jasson et al., 2010).

Como una alternativa a esta problemática, el desarrollo de las técnicas de biología molecular para la detección de microorganismos, fundamentalmente los métodos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (‘Polimerase Chain Reaction’), o PCR, por sus siglas en inglés, proporcionan una estrategia rápida y sensible para la detección de diferentes patógenos (Feng et al., 2001; Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004; Jasson et al., 2010).

La detección de Salmonella mediante técnicas moleculares se basa fundamentalmente en la detección del gen invA, específico para el género Salmonella (Singer et al., 2006). Este gen, codificado en el cromosoma bacteriano en una región conocida como isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI1), se encuentra directamente relacionado con el proceso de invasión al epitelio intestinal (Chacón et al., 2010).

El objetivo de este trabajo fue evaluar un método basado en la PCR para la detección de Salmonella spp. en muestras de lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) para su implementación en un laboratorio de microbiología de alimentos de la ciudad de Rosario, Argentina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestra de alimento

Para el desarrollo de esta metodología se empleó lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata), adquiridas en locales comerciales de la ciudad de Rosario, Argentina. Las hojas de lechuga fueron sometidas a un proceso de lavado-desinfección con solución acuosa de cloro para reducir la carga microbiana.

Bacterias utilizadas

Se utilizaron las cepas control de calidad Salmonella enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, 50 aislamientos de Salmonella spp. de origen humano, animal y alimentario, y 30 cepas de microorganismos diferentes a Salmonella spp. de origen humano, animal y alimentario, provenientes de la colección de cepas perteneciente al grupo de investigación del Área Bacteriología, Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario (Argentina). Se siguieron lineamientos de la AOAC International (2012).

Técnica de cultivo

A 225 mL de caldo lactosado (Oxoid, Ltd., UK) se agregaron 25 g de lechuga y se incubó durante 24 h a 35 ºC. Posteriormente, se subcultivó el caldo lactosado en caldos tetrationato (caldo TT) y Rappaport-Vassilialis (RV) (Oxoid, Ltd., UK). Las muestras y controles se incubaron a 35 ºC por 24 h, con posterior inoculación en agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD) y Hektoen (HK) (Oxoid, Ltd., UK). Las placas se incubaron por 24 h a 35 ºC y se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC). Las colonias sospechosas de Salmonella se analizaron por su perfil bioquímico empleando el kit API® 20E (bioMérieux, Francia).

Preparación de la muestra del alimento

La norma ISO 16140:2003 propone que los microorganismos inoculados artificialmente a un alimento deben encontrarse en condiciones similares a las que se encuentran naturalmente en el alimento. Por ello, se realizó la contaminación artificial del alimento con microorganismos estresados o dañados. El protocolo de stress sobre las células bacterianas consistió en la inoculación de 50 mL de caldo tripteína soya con 10⁵ UFC/mL del cultivo bacteriano de 24 h de crecimiento. Estas suspensiones se incubaron durante 7 h a 37 ºC y, posteriormente, el cultivo fue conservado durante 18 h a 4 ºC. A continuación, las células bacterianas fueron sometidas a un tratamiento térmico a 55 ºC durante 5 min. La viabilidad de las células bacterianas posterior a la lesión sub-letal, se determinó mediante evaluación del crecimiento bacteriano en agar Salmonella-Shigella y agar tripteína soya con el agregado de 6 g/L de extracto de levadura (ISO, 2003; Dodd et al., 2007).

Contaminación del alimento

Se estudiaron 5 niveles de contaminación del alimento con el microorganismo estresado. Las concentraciones finales en el caldo lactosado correspondieron a 10⁵, 10⁴, 10³, 10² y 10¹ UFC/mL de S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076. Se procesó un control negativo de muestra, un control negativo de reactivo, un control negativo y un control positivo.

Extracción de ADN bacteriano

Se efectuó la extracción del ADN bacteriano a partir del caldo lactosado y de los caldos RV y TT luego de que estos fueran incubados 24 h a 42 ºC y 37 ºC, respectivamente. Se colocó 1 mL de los caldos mencionados en tubos Eppendorf y se centrifugaron 5 min a 10000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet con 1 mL de solución fisiológica. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 100-200 μL de agua destilada estéril. Esta suspensión se calentó a 94 ºC durante 15 min y se centrifugó 3 min a 13000 rpm. Se utilizó 2 μL del sobrenadante como templado para la reacción de PCR (Ridley, 1998).

Detección del gen invA mediante PCR

La detección del gen invA se realizó mediante PCR utilizando los cebadores específicos, invA-F: 5’-GCTGCGCGCGAACGGCGAAG-3’ e invA-R: 5’-TCCCGGCAGAGTTCCCATT-3´ (Ferretti et al., 2001). La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 25 μL en buffer Taq 1X; 2 mM de MgCl₂ ; 0,12 pM de cada cebador; 0,2 mM de cada dNTP y 0,5 U de Taq polimerasa. A esta mezcla de reacción se adicionó 2 μL del ADN bacteriano. El protocolo de amplificación consistió en 32 ciclos; 1 ciclo inicial 2 min a 94 ºC, 30 ciclos 1 min a 94 ºC, 1 min a 60 ºC, 1 min a 72 ºC y el último ciclo 5 min a 72 ºC empleando el termociclador MyCycler^TM Thermal Cycler System (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Los productos de PCR se detectaron por electroforesis en gel de agarosa al 2 % con tinción de bromuro de etidio (0,5 μg/mL), durante 45 min a 140 mV. Las bandas se visualizaron con un transiluminador UV de doble intensidad DyNA Light (Labnet International, Inc., NJ, USA). El tamaño de la banda de amplificación correspondiente al gen invA (389 pb) se comparó con el marcador de peso molecular de 100 pb (Promega Corporation, WI, USA). Se utilizaron como control positivo ADN de la cepa S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076 y, como control negativo, ADN de la cepa E. coli ATCC 25922.

Ensayo de inclusividad

Se analizaron 50 aislamientos de Salmonella spp. de origen humano (n = 49) y animal (n = 1). Se sembraron en agar XLD y agar Salmonella-Shigella. Posteriormente, se procedió a la extracción de ADN, amplificación y revelado.

Ensayo de exclusividad

Se analizaron 30 aislamientos diferentes a Salmonella spp. de origen humano (n = 22), animal (n = 4) y alimentario (n = 4) (Cuadro 1). Se sembraron en agar Mueller-Hinton y agar Sangre, según los requerimientos nutricionales para su crecimiento. Posteriormente, se procedió a la extracción de ADN, amplificación y revelado.

Límite de detección del método

Para establecer el límite de detección (LD) se ensayaron 10 concentraciones diferentes de ADN bacteriano mediante PCR (100 µg/mL, 50 µg/mL, 10 µg/mL¸ 1 µg/mL; 0,75 µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,25 µg/mL; 0,125 µg/mL y 0,0625 µg/mL). Este estudio se realizó empleando la cepa S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076. Se cuantificó la concentración de ADN a 260 nm y a 280 nm utilizando espectrofotómetro marca UNICO® (UNICO® NJ, USA) y se prepararon diluciones del mismo para su posterior amplificación y revelado.

Efecto de posibles inhibidores presentes en la muestra

La presencia de inhibidores de la PCR en la muestra a analizar fue evaluada empleando el caldo lactosado y los caldos RV y TT, a distintos niveles de concentración de S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076. Se procesaron controles negativos de muestra, de reactivo y un control negativo utilizando la cepa de E. coli ATCC 25922 y, finalmente, un control positivo empleando la cepa control de calidad de S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076.

Especificidad y sensibilidad relativa

Para determinar la especificidad y la sensibilidad relativa del método de PCR, se utilizaron los resultados obtenidos mediante el cultivo tradicional y la técnica de PCR al analizar las muestras inoculadas artificialmente con S. enterica serovariedad Enteritidis ATCC 13076, los controles positivos y negativos.

Eficacia o concordancia

Se realizaron estudios de concordancia mediante la determinación del índice de concordancia Kappa (Κ) (Ochoa-Azze, 2012).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Salmonella ocupa un rol preponderante entre las bacterias que causan ETA. Por ello, es esencial una pronta y adecuada detección de esta bacteria en los alimentos. La mayoría de estos métodos se basan en técnicas tradicionales de cultivo que, aunque no demandan infraestructuras especialmente costosas, son métodos largos y laboriosos que retrasan el tiempo de obtención de resultados. En los últimos años los esfuerzos fueron destinados al desarrollo de métodos rápidos que reduzcan el tiempo de obtención de resultados con una adecuada validación frente al método de referencia (Jasson et al., 2010).

En el presente trabajo se analizó la detección de Salmonella spp. en lechuga (L. sativa L. var. Capitata) mediante la técnica de PCR y su comparación con el cultivo microbiológico, de acuerdo a lo requerido por el Código Alimentario Argentino (CAA, 2017) en Resolución Conjunta SPReI y SAV Nº 4 - E/2017, sobre las normas microbiológicas para Salmonella spp. y sus métodos de referencia.

La variedad de lechuga fue seleccionada porque es una planta de crecimiento anual que se consume durante todo el año y es frecuente encontrarla como ingrediente de ensaladas listas para el consumo.

Tanto para la extracción de ADN, como para el procesamiento de las muestras, la premisa fue utilizar métodos simples y económicos disponibles en los laboratorios de análisis de alimentos que utilizan PCR de manera de poder aplicar esta metodología como tamizaje para la detección del género Salmonella en lechuga pudiendo obtener un resultado en un plazo menor al de la técnica de referencia.

Ferretti et al. (2001) seleccionaron el gen invA para la detección del género Salmonella mediante PCR. Este gen codifica para una proteína bacteriana responsable de la invasión a la célula epitelial del huésped. Desde entonces, el gen invA fue adoptado como marcador genético del mencionado género bacteriano (Malorny et al., 2003). Diferentes estudios emplearon la detección de este gen sobre colonias bacterianas y sobre distintas matrices alimentarias (Lampel et al., 2000; Malorny et al., 2003; Nagappa et al., 2007; Karmi, 2013).

En este trabajo, la determinación de la inclusividad de la PCR para la detección del gen invA sobre 50 aislamientos de Salmonella spp. evidenció una inclusividad de la mencionada técnica del 100 % (Cuadro 2). En la Fig. 1 se muestran las bandas de amplificación de 389 pb, correspondientes al gen invA, detectadas en los diversos aislamientos de Salmonella spp. ensayados. Estudios similares realizados por Rahn et al. (1992) han informado la detección del gen invA por PCR en 630 cepas de Salmonella, excepto de S. litchfield y S. senftenberg. Salehi et al. (2005), detectaron la presencia del gen invA por PCR al analizar 30 cepas de Salmonella recuperadas a partir de muestras de pollo.

En este estudio, al ensayar la exclusividad de la técnica, no se observó la presencia de bandas de amplificación en la totalidad de las cepas distintas al género Salmonella ensayadas (Fig. 2), estableciéndose una exclusividad del 100 % (Cuadro 2). Resultados similares fueron obtenidos por Rahn et al. (1992) al analizar 142 cepas de bacterias diferentes a Salmonella y por Salehi et al. (2005) al evaluar aislamientos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

En la Fig. 3 se observan los resultados obtenidos al analizar el límite de detección de la PCR en estudio. La banda de amplificación esperada de 389 pb se observó hasta una concentración de 1,0 µg/mL de ADN, fijándose esta concentración de ADN como la mínima concentración detectable mediante esta técnica (Cuadro 3).

Diversos estudios determinaron la mínima concentración ADN detectada mediante PCR para detección del gen invA sobre diferentes matrices alimentarias. Pérez et al. (2008) demostraron la capacidad de detección mínima de 0,027 µg/mL de ADN de Salmonella en muestras de clara-yema de huevos. Por otra parte, Hernández et al. (2014) detectaron concentraciones de hasta 0,310 ng/µL de ADN de Salmonella typhimurium.

Las técnicas microbiológicas son reconocidas como los métodos de referencia para la búsqueda de Salmonella (Malorny et al., 2003). Por ello, se empleó esta metodología, recomendada por el CAA (2017), para el aislamiento de Salmonella spp. en vegetales para posteriormente realizar el análisis de la presencia inhibidores en la muestra y la comparación con los resultados obtenidos mediante la PCR evaluada en este estudio. Un problema que se repite en las muestras de alimentos es la presencia de inhibidores, donde el microorganismo objeto de estudio puede ser inhibido por la flora acompañante o la sensibilidad del ensayo de PCR puede resultar disminuida (Di Pinto et al., 2007). La existencia de inhibidores en muestras de alimentos, puede actuar a diferentes niveles durante el proceso de extracción y amplificación de los ácidos nucleicos y, eventualmente, conducir a la obtención de resultados falsos negativos (Rossen et al., 1992; Alcázar-Montañez et al., 2006). Al analizar el ADN proveniente de los caldos lactosado, TT y RV, se detectó el producto de amplificación de 389 pb correspondiente al gen invA en todas las muestras de lechugas inoculadas artificialmente con diluciones en el intervalo de concentraciones comprendido entre 10¹ a 10⁵ UFC/mL. No se observó un efecto inhibidor del alimento en estudio sobre la reacción de PCR (Fig. 4).

Se analizó la detección del género Salmonella en lechuga (L. sativa L. var. Capitata) por medio del cultivo convencional y la PCR. El método molecular permitió la detección de Salmonella en el intervalo de concentraciones comprendido entre 10¹ y 10⁵ UFC/mL. Para todas las reacciones de amplificación el desempeño de los controles (control negativo de muestra, control negativo de reactivo, control negativo y control positivo) fue el esperado (Cuadro 4).

Por otra parte, se demostró un muy buen grado de concordancia entre el cultivo y la técnica de PCR, ya que el valor calculado del índice K fue de 1.

La PCR para detección del gen invA, marcador del género Salmonella, evaluada en este trabajo fue incorporada a un laboratorio de microbiología de alimentos de la ciudad de Rosario (Argentina) para realizar la evaluación de la sanidad de las hojas de lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) destinadas a consumo humano.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos demostraron que la técnica molecular de PCR para la detección del gen invA es una alternativa valiosa para la detección de Salmonella spp. en hojas de lechuga (Lactuca sativa L. var. Capitata) debido al elevado porcentaje de inclusividad y exclusividad de la mencionada técnica. El límite de detección fue de 1,0 µg/mL de ADN. Además, este trabajó evidenció que el método molecular y las técnicas microbiológicas convencionales (cultivo microbiológico) ensayadas presentaron un buen grado de concordancia.

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