Âncora

Introdução

Bactérias são organismos unicelulares que comumente apresentam-se como células individuais em forma esférica, em bastonete, em espiral e, ocasionalmente, na forma de filamentos ramificados. Tipicamente, essas células possuem uma parede celular rígida, formada por uma camada de peptideoglicano e reproduzem-se por fissão binária. As bactérias são menores e menos complexas do que as células eucarióticas e não contêm organelas circundadas por membranas. O genoma principal das bactérias contém informação genética necessária para a sobrevivência desses microrganismos, composto, de forma geral, por um único cromossomo circular. A membrana nuclear e o nucléolo estão ausentes. Uma típica célula bacteriana é composta por uma cápsula, paredecelular, membrana celular, citoplasma (contendo material nuclear) e apêndices como flagelos e pili.

Com base na coloração pelo método de Gram, as bactérias podem ser divididas em dois grupos principais, gram-positivas e gram-negativas, e essa coloração é determinada pela composição da parede. A coloração de Gram somente é um recurso rápido e útil quando for corretamente realizada (do ponto de vista técnico) e interpretada por profissionais experientes.

Bactérias gram-positivas e gram-negativas

A maioria das bactérias tem uma parede celular, composta por peptidoglicano (também chamado de mureína ou mucopeptídeo), que circunda a membrana plasmática. Além de conferir rigidez e a forma da célula, a parede celular também tem como funções a proteção, o que evita que a célula se rompa (lise celular) quando a pressão osmótica dentro da célula é maior que a do meio externo, e a ancoragem para os flagelos. As bactérias podem ser classificadas como gram-positivas ou gram-negativas. Essa classificação é feita de acordo com a resposta à coloração de Gram em diferenças estruturais nas paredes celulares.

Bactérias gram-negativas

As paredes celulares das bactérias gram-negativas têm uma ou poucas camadas de peptidoglicano, mas são mais complexas estrutural e quimicamente em relação às gram-positivas. Somente as gram-negativas têm uma membrana externa, que é constituída de LPSs, lipoproteínas e fosfolipídios (Figura 1) . Exemplos de bactérias gram-negativas de importância veterinária são a Escherichia coli, Proteus spp, Klebsiella spp, Actinobacillus spp, Pseudomonas spp, Salmonella spp, Haemophilus spp, Brucella spp , entre outras.

As funções da membrana externa incluem manter a estrutura bacteriana, conferir defesa celular e funcionar como uma barreira de permeabilidade a grandes moléculas e moléculas hidrofóbicas. A membrana externa, porém, permite uma permeabilidade seletiva por intermédio das proteínas da membrana (porinas) as quais formam canais que permitem a passagem de determinadas moléculas, como nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro.

O espaço periplásmico das bactérias gram-negativas compreende a área entre a superfície externa da membrana citoplasmática e a superfície interna da membrana externa e é constituído pelo periplasma, um fluido semelhante a um gel que contém várias enzimas de degradação e proteínas de transporte.

Algumas espécies de bactérias gram-negativas têm enzimas β-lactamases no espaço periplásmico, que degradam antibióticos da classe β-lactâmicos, como, por exemplo, a penicilina, podendo ser, portanto, naturalmente resistentes a essa classe de antibióticos. O LPS, constituinte da membrana externa, é uma molécula grande, anfipática (extremidades hidrofóbicas e hidrofílicas) e complexa. O LPS é uma endotoxina extremamente tóxica, sendo considerado um potente estimulador de respostas imunológicas no hospedeiro, podendo causar febre, choque e outros sintomas graves. O LPS (Figura 2) é constituído por três unidades distintas:

1. Lipídio A (responsável pelos efeitos tóxicos);

2. Cerne polissacarídeo — formado por cinco açúcares ligados ao lipídio A, tem a função estrutural de estabilidade;

3. Polissacarídeo O (ou antígeno O) — composto por moléculas de açúcar, tem a função de antígeno, sendo útil para diferenciar espécies bacterianas gram-negativas, já que existe grande variabilidade entre espécies e cepas bacterianas.

Bactérias gram-positivas

As paredes celulares das bactérias gram-positivas são mais espessas e rígidas em comparação às das gram-negativas, pois têm várias camadas de peptidoglicano. O espaço periplásmico também está presente, porém, nas bactérias gram-positivas, há uma camada granular composta por ácido lipoteicoico. Apenas as bactérias gram-positivas contêm ácidos teicoicos (presente na maioria das espécies de bactérias gram-positivas), que são polímeros hidrossolúveis de poliol fosfatos situados na camada externa da parede celular (Figura 3). Quando estão ligados à camada de peptidoglicano, são classificados como ácidos teicoicos da parede, porém, quando atravessam a camada de peptidoglicano, ligando--se aos lipídios da membrana citoplasmática, são classificados como ácidos lipoteicoicos (têm um ácido graxo).

Os ácidos teicoicos são antígenos de superfície das bactérias gram-positivas que favorecem a ligação com outras bactérias e receptores específicos de células de mamíferos (fenômeno patogênico chamado de aderência), podendo ser utilizados na diferenciação de sorotipos bacterianos. Além disso, os ácidos teicoicos são importantes fatores de virulência, pois são capazes de induzir choque séptico no hospedeiro. Alguns exemplos de bactérias gram-positivas são de importância veterinária são: Staphylococcus aureus, Corynebacterium spp, Clostridium spp, Corynebacterium pyogenes, Bacillus spp, Streptococcus spp, Actinomyces bovis, entre outras.

Coloração de Gram

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem à sua descoberta pelo o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram e modificada por Hucker em 1921. Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.

Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características dos agrupamentos. Devem–se utilizar, de preferência, lâminas limpas e novas (não oxidadas). Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso. Se utilizada cultura em caldo, deve-se transferir uma gota para uma lâmina limpa utilizando alça bacteriológica ou pipeta e espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregaço delgado. Caso seja um meio sólido deve se utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa e transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica, misturando suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo.

Durante as primeiras etapas da coloração, o corante cristal de violeta e o iodo são incorporados ao citoplasma das bactérias, entretanto, ao adicionar um descorante, algumas bactérias se tornam incolores, sendo então denominadas gram-negativas, enquanto outras permanecem coradas de azul/púrpura, sendo estas chamadas de gram-positivas.

Tendo em vista que as bactérias gram-negativas se tornam incolores depois da descoloração, é necessário que elas sejam, então, coradas para que possam ser visualizadas no microscópio de campo claro, para isto, utilizam-se os corantes vermelho safranina ou fucsina.

Para corar as bactérias pelo método de Gram, inicialmente se confecciona um esfregaço em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor ou pela utilização de metanol ou de etanol, após, realiza-se a técnica de coloração de Gram, que consiste nas seguintes etapas (Figura 4):

1. Adição do corante básico cristal de violeta, que cora as células de azul/púrpura.

2. Lavagem da lâmina com água de torneira ou solução de iodo.

3. Adição de solução de iodo (mordente), que forma um complexo cristal violeta-iodo, mantendo as células coradas de azul.

4. Descoloração da lâmina com um solvente orgânico (álcool ou solução álcool-acetona), que remove a coloração azul das bactérias gram-negativas (as quais ficam incolores), mas mantém a coloração azul nas bactérias gram-positivas.

5. Lavagem da lâmina com água de torneira.

6. Adição do corante básico vermelho safranina ou fucsina, que cora as bactérias gram-negativas de rosa/vermelho.

7. Lavagem com água de torneira e secagem da lâmina.

A retenção, ou não, do corante cristal de violeta é explicada devido a algumas diferenças estruturais das paredes celulares das bactérias gram-positivas e gram-negativas. As bactérias gram-positivas têm uma parede celular mais espessa em relação às gram-negativas, a qual é composta por várias camadas de peptidoglicano, enquanto somente as bactérias gram-negativas têm LPSs na parede celular. O cristal de violeta e o iodo penetram facilmente nas células das bactérias, formando um complexo insolúvel de cristal violeta-iodo, que é maior do que a molécula de cristal que entrou na célula.

Quando as células são lavadas com álcool ou solução álcool-acetona, podem ocorrer duas situações: as bactérias gram-negativas conseguem eliminar o complexo cristal violeta-iodo, que atravessa uma camada fina de peptidoglicano, uma vez que o álcool penetra e rompe a camada externa de LPSs; as bactérias gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, já que esse complexo não consegue ultrapassar a espessa camada de peptidoglicano.

A coloração de Gram também pode ser usada para diagnosticar infecções fúngicas e pode ser feita com pequenas diferenças na técnica a depender do laboratorio e é portanto, considerada uma técnica diferencial, haja vista que as bactérias gram-positivas são coradas de azul/púrpura, enquanto as gram-negativas ficam na tonalidade rosa/vermelho (Figura 5).

Causas comuns de erro

Alguns erros de técnica podem ocorrer como a precipitação do corante violeta simulando cocos Gram-positivos, o uso de lâminas que não tenham sido pré-limpas ou desengorduradas ou a espessura do esfregaço, que pode corar irregularmente.

Também pode ocorrer o superaquecimento na fixação pelo calor, levando à destruição da morfologia, a descoloração insuficiente com álcool-acetona permite a retenção do cristal-violeta, o que dificulta a observação de bactérias gram-negativas. Por outro lado, esfregaços obtidos de culturas velhas ou contendo numerosas bactérias mortas ou expostas à ação de antibióticos apresentam irregularidades na coloração.

As bactérias gram-positivas podem perder a capacidade de reter o cristal-violeta, apresentando-se gram-negativas e as gram-negativas podem se corar mais fracamente pela safranina, podendo simular a ocorrência de infecções mistas (Gram positivas/Gram-negativas).

A discordância de resultado entre o esfregaço corado pelo Gram e a cultura pode estar relacionada com a coleta ou meios de transportes e conservantes inadequados. Um resultado positivo de Gram com cultura negativa pode sugerir contaminação do corante, presença de agentes antimicrobianos na amostra do paciente ou falha no crescimento de microrganismos devido às condições utilizadas (atmosfera ou ação seletiva dos meios de cultura).

Há um outro grupo de bactérias que não apresentam parede celular e, portanto, não podem ser bem caracterizados pelo método de Gram. É o caso dos gêneros Chlamydia, Chlamydophilae e Mycoplasma. Algumas dessas bactérias são também chamadas de atípicas (especialmente quando se fala em pneumonia por agentes atípicos). Para identificar essa bactérias, deve ser usado o método de Ziehl-Neelsen.

A identificação de espécies bacterianas faz parte da rotina de laboratórios de bacteriologia clínica. Dessa forma, diferentes técnicas de coloração são utilizadas para que seja possível observar as bactérias em microscopia de campo claro, já que os corantes aumentam o contraste e facilitam a visualização.

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