Descripción de la Unidad

La Microscopía Confocal se encuentra englobada dentro de la Microscopía óptica, concretamente de la Microscopía de fluorescencia y permite el estudio de muestras con marcaje fluorescente, haciendo secciones ópticas de las mismas mediante la excitación de la muestra punto a punto por medio de un barrido láser.

El microscopio Confocal permite que solo observemos el plano que está situado en el punto de foco, eliminando de forma óptica a través de un diafragma o “pinhole", la luz proveniente de los planos que están fuera de foco.

La combinación de la captación de imágenes en el plano focal con el software permite la utilización del microscopio confocal como un “microtomo óptico”, lo cual posibilita la obtención de secciones ópticas de la muestra, base para la obtención de imágenes en tres dimensiones.

El desarrollo de nuevas sondas fluorescentes y el aumento de resolución que proporciona la utilización de la microscopía confocal han hecho posible que la fluorescencia sea una de las técnicas más utilizadas en la actualidad.

APLICACIONES

La Microscopía Confocal supone un avance en el campo de la Microscopía óptica y nos posibilita el estudio tridimensional de las muestras, incluyendo su interior, y en determinados materiales permite la obtención de imágenes de  la superficie de la muestra mediante reflexión.

También se aplica para el estudio de muestras in vivo a lo largo de una secuencia temporal o para la colocalización de distintos marcadores en una región concreta. El microscopio está dotado con un sistema de detección espectral por lo que permite obtener las curvas de autofluorescencia de diferentes muestras, los espectros de emisión de los fluoróforos, si se desconocen y, eliminar o minimizar problemas de solapamiento de espectros. También se pueden aplicar nuevas técnicas como FRET , FRAP, FLIP...

EQUIPO

La unidad de Microscopía del Hospital Puerta de Hierro está equipada con un Microscopio Confocal Leica SP5, con tres líneas láser, está optimizado para la adquisición de imágenes a partir de muestras, tanto fijadas como in vivo, que no requieran de unas condiciones ambientales específicas. En este sistema contamos con 3 líneas láser de excitación:

  • Láser de Argón, que excitará a las siguientes longitudes de onda; 458, 477, 488, 496 y 514 nm.
  • Láser de Helio/Neón (He/Ne), que excita a 543 nm.
  • Láser de Helio/Neón (He/Ne) que excita a 633 nm.

REQUERIMIENTO DE LAS MUESTRAS

Las muestras a observar mediante microscopía confocal deben ser planas y estar montadas en un medio libre de fluorescencia. La adquisición de imágenes a partir de células en cultivo requiere el uso de medio de cultivo sin rojo-fenol, para reducir la autofluorescencia.