Spektrokolorymetr (spektrofotometr)
Opisany w artykule przyrząd służy do pomiaru stężeń substancji barwnych lub takich, które posiadają barwne produkty reakcji. Wykorzystuje on zjawisko selektywnej absorpcji promieniowania np. obecny w roślinach chlorofil absorbuje barwy czerwoną i niebieską a praktycznie nie absorbuje barwy zielonej. Jeśli przyjmiemy (upraszczając), że barwę białą jesteśmy w stanie otrzymać mieszając w odpowiednich proporcjach barwy podstawowe: czerwoną, zieloną, niebieską, to właśnie zabranie barw czerwonej i niebieskiej da nam barwę zieloną, inny przykład, popularny związek do odkażania nadmanganian potasu (do kupienia w każdej aptece) ma barwę intensywnie fioletową, ze światła białego pochłania on barwę zieloną przepuszczając czerwoną i niebieską, które mieszając się dają barwę fioletową. Sprawę postrzegania barw komplikuje dodatkowo różna czułość oka ludzkiego dla różnych barw. Oko nasze wykryje znacznie mniejsze natężenie światła zielonego niż niebieskiego czy czerwonego. Na szczęście nie musimy przewidywać, jaką długość fali (barwę światła) dany związek chemiczny najsilniej zaabsorbuje, wystarczy wpisać w internecie hasło widmo absorpcyjne (po angielsku absorption spectrum) i nazwę związku. W odpowiedziach najczęściej otrzymamy wykres będący widmem absorpcyjnym, w którym na osi x odłożona będzie długość fali, na osi y absorbancja (zdolność do pochłaniania fali świetlnej o określonej częstości -długości fali) lub dane o długościach fali przy, których dany związek najsilniej absorbuje promieniowanie. Te same informacje można znaleźć również w poradnikach analitycznych. Oznaczenie prowadzi się najczęściej dla długości fali, dla której dany związek pochłania najsilniej promieniowanie świetlne ze względu na maksymalną czułość takiego oznaczenia. Długość fali przy której prowadzi się oznaczenie nazywa się długością analityczną. Przyrządy tego typu stanowią podstawowe wyposażenie praktycznie każdego laboratorium analitycznego. Rozróżnienie pomiędzy spektrofotometrem a spektrokolorymetrem wynika tylko z szerokości widmowej zastosowanego źródła promieniowania optycznego, co zostanie bardziej szczegółowo wyjaśnione w dalszej części tekstu. Zaproponowany układ jest bardzo prosty i nadaje się do odtworzenia nawet przez początkującego elektronika. Główną przyczyną, dla której wykonano ten układ, była chęć pomiaru stężeń różnych substancji w wodzie akwariowej.
Budowa spektrofotometru
Profesjonalny spektrofotometr zbudowany jest ze źródła promieniowania ciągłego -lampy deuterowej lub halogenowej, monochromatora -przyrządu rozdzielającego widmo ciągłe na poszczególne składniki widma (w monochromatorze otrzymujemy obraz odpowiadający kolorom tęczy) -monochromator wykonuje się obecnie z użyciem siatki dyfrakcyjnej, układu wybierającego odpowiednią długość fali, kuwety pomiarowej w której umieszczona jest badana próbka w postaci ciekłej i detektora promieniowania optycznego (np. fotodiody, fotopowielacza). Przykład takiego układu pokazano na rysunku 1. Z rysunku tego widać, że głównym problem jest otrzymanie światła o ściśle określonej długości fali (barwie). Problem ten można rozwiązać stosując różnobarwne diody LED. Wadą diod LED jest dość szerokie widmo emisyjne, szerokość połówkowa widma emisyjnego typowej diody LED wynosi około 25nm (szerokość w połowie wysokości piku). W dobrej klasy spektrofotometrach fabrycznych szerokość widmowa wiązki wynosi obecnie nawet poniżej 0,5 nm. Widma absorpcyjne zdecydowanej większości związków mają zwykle szerokość połówkową na poziomie około 50nm, dzięki czemu możemy zastosować źródła o szerszym widmie emisyjnym. Pokrycie całego zakresu światła widzialnego wymaga w tym wypadku zastosowania większej ilości diod LED o barwach zmieniających się od czerwieni do barwy niebieskiej (ultrafioletu). Takie rozwiązanie ogranicza nieco liczbę mierzonych związków, z drugiej strony wymaga bardzo małych nakładów finansowych i minimalnej ilości prac mechanicznych. Węższe widmo emisyjne mają lasery półprzewodnikowe, są one jednak znacznie droższe i posiadają znacznie mniejszy wybór długości emitowanych fal. Diody LED w zależności od producenta różnią się długością emitowanej fali świetlnej (barwą), np. czerwień jednego producenta nie jest równa czerwieni innego producenta, dzięki czemu możemy zdobyć większą ilość źródeł o różnej długości fali. Światło widzialne obejmuje zakres od około 400 do 700 nm.
Podstawowe zależności fizyczne
W układzie pomiarowym z rysunku 1 możemy otrzymać informację o natężeniu światła emitowanego przez źródło i pochłoniętego przez próbkę. Iloraz natężenia światła przepuszczonego przez próbkę i promieniowania padającego na próbkę nosi nazwę transmitancji. Posługiwanie się wartością transmitancji jest niewygodne i w praktyce posługujemy się pojęciem absorbancji, która jest logarytmem dziesiętnym z odwrotności transmitancji. Roztwór o większej wartości absorbancji ma bardziej intensywną barwę i jednocześnie większe stężenie substancji barwnej. Zależność absorbancji od stężenia substancji opisuje prawo Lamberta -Beera, jest ono podstawowym prawem w spektrofotometrii. Zależność ta mówi, że absorbancja jest proporcjonalna do stężenia substancji barwnej, długości drogi optycznej na której zachodzi absorpcja promieniowania (pozwala to mierzyć mniejsze stężenia substancji wydłużając drogę, na której zachodzi absorpcja promieniowania) i od wielkości stałej dla danego związku chemicznego nazywanej molowym współczynnikiem absorpcji.
Część mechaniczna Bardzo
ważna w tym układzie jest część mechaniczna, wykonanie jej nie
powinno przysporzyć jednak żadnych problemów, w przypadku
zastosowania jako źródła promieniowania jednej diody LED. Serce
układu stanowi czarna obudowa plastikowa. W obudowie tej znajduje
się dioda LED (źródło promieniowania), detektor promieniowania
(fotodioda krzemowa) i miejsce na kuwetę, w której znajduje się
roztwór mierzony. Wszystkie części wewnętrzne komory pomiarowej
powinny być koloru czarnego lub być pokryte czarną farbą matową.
Fotodioda krzemowa znajduje się na końcu czarnej matowej tulejki o
długości około 1cm wykonanej z obudowy długopisu, zamocowanej na
wsporniku z laminatu przykręconego do dna obudowy. Szczegóły
techniczne zastosowanego rozwiązania pokazano na fotografii nr 1.
Zastosowanie tulejki osłaniającej fotodetektor i pokrycie wnętrza
komory pomiarowej farbą matową o barwie czarnej (lub zastosowanie
czarnej obudowy) zmniejsza poziom promieniowania rozproszonego
(szkodliwego) w naszym przyrządzie. Układ powinien mierzyć tylko
promieniowanie przechodzące przez kuwetę z roztworem pomiarowym.
Źródło promieniowania powinno być tak ustawione, by jak
największa część promieniowania trafiała na fotodetektor (dioda
LED musi emitować promieniowanie prostopadle do powierzchni
fotodetektora). Prawidłowe ustawienie fotodetektora względem diody
LED pokazano na fotografii 2.
Diody LED umieszczone zostały w prototypie na końcówkach złącz cinch o różnej barwie. Barwa końcówki złącza informuje jednocześnie o barwie zastosowanej diody LED (fotografia 3).
Dokładne ustawienie fotodiody LED w zaproponowanym układzie względem powierzchni fotodetektora uzyskuje się odpowiednio doginając diodę LED. Przyjęte rozwiązanie umożliwia pomiar tylko przy zastosowaniu światła o jednej długości fali. Zmianę długości fali świetlnej uzyskuje się przez wymianę diody LED zamontowanej na złączu cinch. Rozwiązaniem, które umożliwia wykorzystanie paru diod LED jest zastosowanie układu nazwanego karuzelą (stosowane np. w spektrometrach absorpcji atomowej), w układzie tym diody LED znajdują się na ruchomym okręgu w stałej odległości od środka, obrót o określony kąt pozwala wybrać żądaną diodę LED. Kąt obrotu takiego układu powinien być ograniczony, ponadto w danej chwili powinna pracować tylko jedna dioda LED, co możliwe jest do uzyskania dzięki zastosowaniu przewodu elastycznego i przełącznika obrotowego. Dokładne ustawienie diody LED umożliwia obserwacja poziomu sygnału z diody LED (znalezienia maksimum sygnału). W układzie tym diody świecące wymagają dokładnego ustawienia tylko za pierwszym razem. Kuweta pomiarowa wykonana jest z przezroczystego opakowania po Tic-Tac -ach. Prezentowane rozwiązanie nie jest najlepsze, gdyż taka kuweta łatwo się zarysowuje, posiada dużą pojemność, jest jednak najprostsze do wykonania w warunkach amatorskich. Część kuwety pomiarowej, która wystaje ponad górną pokrywę komory pomiarowej, owinięta jest czarną taśmą izolacyjną. Kuweta przechodzi przez otwór w obudowie o wymiarach odpowiadających dokładnie wymiarom poprzecznym kuwety. Dużo lepszym rozwiązaniem byłoby zastosowanie oryginalnej kuwety fabrycznej szklanej, polistyrenowej lub jakiegoś zbiorniczka szklanego o kształcie prostopadłościanu, ale o dwóch dokładnie równoległych ściankach (nie zaokrąglonych) o odległości między wewnętrznymi ściankami na poziomie 1 cm. Kuwety szklane są bardziej odporne na agresywne czynniki chemiczne i nie barwią się w sposób trwały od badanej substancji jak niektóre tworzywa. W zakresie promieniowania ultrafioletowego stosuje się kuwety ze szkła kwarcowego, które w znacznie mniejszym stopniu absorbują promieniowanie UV niż zwykłe szkło. W bardziej rozbudowanym urządzeniu warto byłoby umieszczać próbkę nie w otworze wyciętym w górze obudowy, ale zamykać na czas pomiaru w przyrządzie (tak jak to się dzieje w profesjonalnych spektrofotometrach), w tym wypadku należałoby zastosować odpowiednie prowadnice kuwety tak, by kuweta była zawsze dokładnie w tej samej pozycji względem diody LED i fotodetektora.
Układ elektroniczny opisany jest w EDW Posługiwanie się przyrządem, procedura pomiarowa.
Pomiary należy wykonywać parę minut po włączeniu zasilania urządzenia, zmniejsza to wpływ dryftu termicznego podzespołów użytych w przyrządzie. Wkładamy do układu diodę LED o wybranej barwie, ustawiając ją tak, by dawała największe napięcie na wyjściu przetwornika prąd -napięcie. Wstawiamy roztwór odnośnika. Najczęściej funkcję odczynnika pełni czysty rozpuszczalnik. W przypadku, gdy badany roztwór do analizy uzyskujemy w wyniku reakcji badanej próbki z odczynnikami, funkcję odnośnika pełnią reagenty użyte w reakcji (nie dodajemy próbki) uzupełnione odpowiednim rozpuszczalnikiem. Tak przygotowana próbka nosi nazwę odnośnika, nazywana jest również popularnie jednak niezbyt poprawnie ślepą próbą. Na odnośnik zerujemy aparat, pozwala to wyeliminować wpływ pochłaniania światła przez kuwetę pomiarową, jak i automatycznie uwzględnia wpływ zanieczyszczeń badaną substancją odczynników użytych do analizy -wynik pomiaru każdej z próbek będzie pomniejszany zawsze o stałą wartość zależną od zawartości oznaczanej substancji w odczynnikach użytych do analizy. Podczas zerowania aparat automatycznie wybierze wymaganą wartość wzmocnienia, po wyzerowaniu absorbancja powinna wynieść plus minus parę tysięcznych. Następnie wkładamy roztwór mierzonej substancji barwnej i odczytujemy wartość absorbancji, przyjmuje się, że optymalny zakres przyrządu wynosi od 0,05 do 0,6 absorbancji co wynika z poziomu absorpcji promieniowania (największe błędy uzyskuje się dla bardzo małych i dużych poziomów pochłaniania promieniowania, zastosowana skala ma charakter logarytmiczny). Do analizy stężeń standardowo używa się metody krzywej wzorcowej, metoda ta zostanie opisana na podstawie analizy roztworów nadmanganianu potasu (do kupienia w aptece). Podczas wszystkich prac z tym odczynnikiem należy pamiętać, że jego roztwory są silnie brudzące, a plamy spowodowane przez ten odczynnik są praktycznie nie do usunięcia. Do analizy przygotowujemy serię roztworów o różnych stężeniach, rozpuszczamy 2,5g nadmanganianu potasu w małej ilości wody a następnie uzupełniamy do 5 dm3. Autor użył wody kranowej, lepsza byłaby woda destylowana lub dejonizowana w tym wypadku należałby nieco inaczej przygotować próbkę ze względu na marnotrastwo oczyszczonej wody (nie jest to dydaktyczne podejście, gdyż ten sam efekt można było osiągnąć przez stopniowe rozcieńczanie próbki, autorowi chodziło jednak o pokazanie idei, a stopniowe rozcieńczanie próbki zostanie opisane dalej). W wyniku rozpuszczenia nadmanganianu potasu w wodzie uzyskaliśmy roztwór o stężeniu 2,5 g KMnO4 na 5 dm3 czyli stężenie nadmanganianu wynosi 0,5g na dm3. Tak otrzymany roztwór rozcieńczamy pięciokrotnie pobierając np. 20 ml i uzupełniając je 80 ml wody do 100ml w suchych czystych kubeczkach. Autor użył nieco innej metody, odmierzył pełną strzykawkę roztworu o stężeniu 0,5g na dm3 KMnO4, a następnie dokładnie 4 takie same pełne strzykawki wody i wymieszał je dokładnie -efekt końcowy dokładnie taki sam, a nie wymaga zastosowania dokładnych naczyń pomiarowych. Tak otrzymano pierwszy z roztworów mierzonych o największym stężeniu 0,1g dm3, otrzymany roztwór miał absorbancję 1,442. Roztwór ten posłużył do dalszych rozcieńczeń. Pobierano około 50 ml roztworu o stężeniu 0,1g na dm3 strzykawką (w praktyce nieco więcej gdyż napełnianą ją do momentu całkowitego odciągnięcia tłoka, proces ten jest bardzo powtarzalny) i mieszano go z równą objętością wodą, w ten sposób otrzymano roztwór o stężeniu dwukrotnie mniejszym od stężenia roztworu wyjściowego czyli 0,05 g na dm3. Czynność rozcieńczania poprzednio przygotowanego wzorca z równymi objętościami wody powtarzano jeszcze czterokrokrotnie, aż otrzymano serię wzorców o stężeniach 0,03125; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 i 0,1 g/dm3. Zmierzono absorbancję tak otrzymanych roztworów używając jako odnośnika wody. Stężenia mierzono od najmniejszego do największego używając każdorazowo do przepłukania kuwety po poprzedniej próbce roztworu aktualnie mierzonego (płukanie kuwety pomiędzy kolejnymi wzorcami prowadzono 2,3 krotnie małymi objętościami próbki). Kuwetę przed pomiarem mieszano, by usunąć ewentualne bąbelki powietrza, jakie znalazły się w roztworze a samą kuwetę wycierano dokładnie do sucha. Ilość roztworu musi być taka, by przechodziło przez nie całe promieniowanie, nie musi jednak wypełniać całkowicie kuwety pomiarowej. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 1.
Odnośnik i roztwór nadmanganianu potasu o absorbancji 0,227 pokazano na fotografii 4
Na podstawie otrzymanych wyników wykreślono zależność nazywaną krzywą wzorcową odkładając na osi x stężenie a na osi y absorbancję. Do opcji wykresu dodano linie trendu wybierając tryb regresji linowy i wyświetlono równanie krzywej wzorcowej oraz wartość współczynnika determinacji R2. Tryb regresji liniowej oznacza iż oczekujemy, że każdej zmianie stężenia odpowiadała będzie proporcjonalna jej zmiana absorbancji, tzn jeśli absorbancja roztworu o stężeniu 0,1 wyniosła 0,1 to roztworowi o stężeniu 0,2 powinna odpowiadać absorbancja dwukrotnie większa czyli 0,2 (zgodnie z prawem Lamberta -Beera). Miarą dokładności zachowania tego prawa jest wartość współczynnika determinacji R2, w przypadku dobrej liniowości wynosi ona nie mniej niż 0,999. Otrzymana przez nas wartość R2 wyniosła 0,9983, co nie jest wartością zbyt dobrą. Już pobieżna analiza wyników wskazuje na przyczynę tego zjawiska, winny jest roztwór o najwyższym stężeniu. Roztwór o stężeniu 0,05 g /dm3 daje absorbancję 0,770, gdy tymczasem roztwór o stężeniu 0,1g/dm3 daje absorbancję 1,442 a w przypadku zależności liniowej powinien dawać 0,77 *2 czyli 1,54. Usunięcie najwyższego z wyników i ponowne wykonanie krzywej w węższym zakresie potwierdza te przypuszczenie, otrzymujemy współczynnik determinacji równy 0,9997 co jest wartością bardzo dobrą. Wartości współczynnika determinacji mogą być pokazane na wykresie lub obliczone za pomocą programu Open Office za pomocą funkcji REGLINP i R.KWADRAT, podają one odpowiednio równanie krzywej wzorcowej przy założeniu jej liniowego charakteru i wartość współczynnika determinacji R2. Dokładniejsze wyniki (nie zaokrąglone), uzyskamy za pomocą wyżej wymienionych funkcji a nie opcji wykresu. W wyniku obliczeń komputerowych otrzymujemy równanie o postaci f(x) = 15,6942x -0,0119, gdzie f(x) jest wartością absorbancji. Podstawiając za wartość f(x) zmierzoną wartość absorbancji, możemy wyliczyć stężenie badanego roztworu, tak przekształcając równanie, by obliczyć wartość x. Krzywa wzorcowa w zakresie liniowym pokazana jest na rysunku 5. Osoby zainteresowane bez problemu wyliczą stężenie manganu w badanej próbce. Oczywiście równanie te możemy stosować tylko w zakresie absorbancji, dla których wyznaczyliśmy wartości współczynników a i b równania o postaci f(x) = ax +b, czyli w naszym przypadku od 0,034 do 0,770 absorbancji. Współczynnik A nazywany jest współczynnikiem nachylenia i mówi nam o czułości metody (im większa wartość A większa tym metoda jest czulsza). W idealnym przypadku wartość drugiego współczynnika b nazywanego również współczynnikiem przesunięcia powinna wynieść zero (wyszło -0,0119). Za różną od zera wartość współczynnika przesunięcia w tym wypadku odpowiada słaba stabilność roztworu o niskim stężeniu (roztwory o małym stężeniu nadmanganianu potasu znane ze swojej niestabilności). Opisana technika krzywej wzorcowej jest bardzo często stosowana w analizie chemicznej. Przyczyn pogorszenia liniowości krzywej wzorcowej dla dużych wartości stężeń (absorbancji) jest wiele, w naszym wypadku krzywa wypadła i tak nadspodziewanie dobrze, a zakres liniowości jest lepszy niż w przypadku starszych aparatów fabrycznych nie wspominając o znacznie prostszej obsłudze tego aparatu uzyskanej dzięki zastosowaniu mikrokontrolera automatyzującego proces pomiarowy. Najważniejszą przyczyną, dla której nasz aparat gorzej mierzy duże wartości stężeń w porównaniu do współczesnych aparatów, jest szerokie widmo emisyjne diody LED. Pomiar dużych wartości stężeń nie stanowi jednak problemu, gdyż badaną próbkę można rozcieńczyć. Na samym dole w załączniku pdf jest krzywa wzorcowa z analizą regresji.
Inne zastosowania -chemia Opisany
układ może służyć również do zastąpienia kłopotliwego
porównywania barwy w przypadku testów akwarystycznych, a stężenie
oznaczanej substancji może być obliczone z absorbancji i krzywej
wzorcowej. Przykłady reakcji mających zastosowanie w akwarystyce
można znaleźć w internecie. W tym wypadku do wyznaczenia każdego
punktu absorbancji krzywej wzorcowej (punktu o danym stężeniu)
najlepiej wykorzystać średnią z paru niezależnie przygotowanych
roztworów o danym stężeniu po odrzuceniu wyników odbiegających
za pomocą testu wykrywającego błędy grube (np Dixona czy
Grubbsa). Możliwy jest również pomiar w zakresie nieliniowym pod
warunkiem, że zagięcie krzywej nie jest zbyt duże, niesie to
jednak za sobą pogorszenie precyzji pomiaru i wymaga zastosowania
nieliniowych typów regresji i rozwiązywania równania nieliniowego.
Na zakończenie podany zostanie przykład ciekawego zjawiska
fluorescencji. Roztwór pod wpływem oświetlenia światłem o
odpowiedniej długości fali świeci światłem o innej barwie, ale o
dłuższej fali (mniejszej częstotliwości) niż źródło
wzbudzające. Na fotografii pokazany jest roztwór Healthosanu
(środek do leczenia ryb akwariowych -uwaga brudzi !) oświetlony
światłem czerwonym zachowuje się zgodnie z oczekiwaniem,
oświetlony światłem niebieskim lub ultrafioletowym zaczyna świecić
na zielono (fotografie 6 i 7).
Zjawisko fluorescencji również wykorzystywane jest w analizie chemicznej wymaga jednak znacznie bardziej rozbudowanej aparatury pomiarowej. Literatura: 1 http://doras.dcu.ie/2242/1/s8042453.pdf 2 A Low Cost LED Based Spectrometer, Journal of the Chinese Chemical Society, 2006, 53, 1067-1072 3 http://www.home.zonnet.nl/rsetteur/aquarium/karel/colorie/coloriemeter_eng.htm |
